長期飲酒致高血壓伴肝損傷小鼠模型的建立

趙士博 吳忠港 張藝馨 謝開仁 于雪瀅 鄭淮遠 潘智 黃鎖義

(右江民族醫學院 1基礎醫學院，廣西 百色 533000；2科學實驗中心；3廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室)

高血壓是世界范圍內的一個主要公共衛生問題〔1～3〕。高血壓多由遺傳因素引起，但其病因尚未明確〔4〕。有統計結果表明，長期飲酒人群患高血壓的風險遠大于普通人。長期飲酒造成高血壓的同時，也為肝臟帶來不同程度損傷。我國目前高血壓發病率仍呈上升趨勢，且高血壓可引發心腦血管等疾病，嚴重影響人們的健康和生活質量〔5〕。高血壓可導致的肌纖維化與心室僵硬，是嚴重的心血管危險因素〔5～7〕，肝有很高的再生潛能〔8〕，如何在臨床治療中對飲酒致高血壓合并肝損傷進行更有效的治療或早期預防十分重要。本研究選用普通級小鼠為實驗動物，建立飲酒致高血壓合并肝損傷的病變模型。以便于進一步研究飲酒致高血壓合并肝損傷的發病機制、臨床治療方案及防治方法。

1 材料和方法

1.1實驗儀器 OLYMPUS BX51透反兩用研究系統顯微鏡〔奧林巴斯(中國)有限公司〕；Thermo ScientificTMHistoStarTM組織包埋機(賽默飛世爾科技中國有限公司)；全自動生化分析儀(日立7600-series)；YLS-1A多動能小鼠自主活動記錄儀(山東省醫學科學院設備站)；ALC-NIBP無創傷血壓測量分析系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)；ALC-HTP動物恒溫系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)；JSC電子天平秤CN-BH；JY0127-91條形盒測力計(規格：10 N)。

1.2實驗試劑 牛欄山二鍋頭白酒62度5 L大桶裝(產品編號：Q/SYSHN0014)；清潔級實驗鼠維持飼料(江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司出品)。

1.3實驗方法與指標檢測

1.3.1動物分組與飼養方法 實驗動物：健康SPF級小鼠100只，雌雄各半，體重30～45 g/只，周齡不詳，由右江民族醫學院動物實驗中心提供。方法：小鼠依性別分為20籠(每籠5只隨機分組并標號)，24 h晝夜周期喂養。經標準飼料適應性喂養1 w后，取雌雄各5籠共50只為對照組，正常食水喂養。其余50均采用自由飲酒法(乙醇體積分數從5%逐漸遞增至25%)建立飲酒型高血壓模型小鼠。

1.3.2一般體征監測 每天定時測定小鼠食量，每3 d測小鼠體重一次。每周測定自主活動、抓力。每30 d測量血壓即收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均脈壓(MBP)，并記錄數據。(1)食量：每天定時稱量每籠小鼠食物總質量，除以每籠小鼠個數，得到24 h內每只小鼠食量。以周為單位計算每只小鼠周平均食量。(2)體重：每3 d稱小鼠體重，統計每只小鼠的體重變化情況。(3)自主活動：采用多功能小鼠自主活動記錄儀，將小鼠置于自主活動儀內預適應10 min后，記錄10 min內小鼠活動次數，測定3次，取平均值。(4)抓力：采用彈簧測力計測定小鼠抓力，將小鼠置于鐵網上，待小鼠用力抓住鐵網時及時加力后拉，測到最大抓力，測定3次，取平均值。(5)血壓：睡眠血壓作為降低心血管疾病風險的治療目標的作用尚不明確〔9〕，因此本研究選擇測量小鼠清醒時期的血壓。應用ALC-NIBP無創傷血壓測量分析系統測定小鼠清醒時的血壓，并固定血壓測定的時間于下午三點進行，避免因不同時間所帶來的干擾。測定血壓之前先打開預熱器加熱，控制室溫在25～30℃。檢測各通道氣密性，保證各通道正常工作。將小鼠裝入鼠籠，調節鼠籠松緊度并置于恒溫毯上預熱10 min。恒溫系統溫度控制在40～45℃。將小鼠鼠尾穿過固定器孔固定好后，將脈搏傳感器有感應面(圓形小膠塊)的一面向上插入脈搏傳感器插孔，推至底部以保證傳感器位置正確，并在電腦中顯示出均勻穩定的波動后即可開始測定血壓。每30 d測定清醒狀態下小鼠SBP、DBP、MBP值。

1.4肝臟組織病理切片觀察 待小鼠SBP高于130 mmHg且保持穩定后于模型組中隨機挑選4只小鼠頸椎脫臼處死，開腹取其肝臟組織，送至右江民族醫學院附屬醫院病理科進行切片制作，請病理科醫生進行查看并給予病理診斷。

1.5肝功能指標的測定 待小鼠SBP高于130 mmHg且病理切片明確反映肝損傷后，禁食12 h，眼球采血并分離血清，送至右江民族醫學院附屬醫院檢驗科測定血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)的含量。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行配對樣本t檢驗。

2 結 果

2.1食量 與對照組比較，模型組食量明顯下降。隨著飲酒周期與飲酒濃度的增加，食量變化幅度較大，且隨著時間推移模型組24 h攝入量整體呈下降趨勢。見表1。

2.2體重 與對照組比較，模型組體重波動較大，后期下降明顯，與飲酒致食欲降低有關。見表1。

2.3自主活動 與對照組比較，模型組自主活動有明顯幅度的下降。隨飼養時間的增長，模型組自主活動整體呈下降趨勢。見表1。

2.4抓力 隨造模時間的增長，模型組出現乏力疲倦，隨給酒濃度的上升，模型組逐漸出現下降趨勢。見表1。

表1 兩組造模不同時間食品、體重、自主活動、抓力比較

2.5血壓 兩組造模60 d、72 d SBP、DBP顯著高于造模30 d(均P<0.01)。兩組間造模60 d、72 d SBP、DBP比較均存在顯著差異(均P<0.01)，且造模72 d差異更顯著。見表2。由于血壓范圍明顯超出正常值，提示高血壓模型小鼠復制可能已經成功。

表2 兩組SBP、DBP、MBP比較

2.6病理切片 自由飲酒喂養72 d，模型組肝臟出現肝細胞水腫，脂肪變性伴細胞壞死，間質少量淋巴細胞浸潤，提示肝細胞出現輕微炎癥。形態學檢查提示模型組肝臟出現病理性改變。見圖1。

圖1 模型組病理切片形態學(HE染色)

2.7肝功能檢測 模型組血清ALT和AST、ALP含量顯著高于對照組(P<0.01)。兩組ALB無統計學差異(P>0.05)。見表3。提示模型組小鼠出現肝損傷。

表3 兩組肝功能指標

3 討 論

高血壓是引發心臟病和腦卒中的主要原因。其發病機制尚不清楚〔10，11〕。酒精性肝損傷初期通常表現為脂肪肝，進而可發展成酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化〔12〕。目前飲酒人群中高血壓患病率高、危害大，過多的鈉鹽、低鉀飲食、飲酒過度、飽和脂肪酸攝入過量致使血壓升高，現今與高血壓有關的疾病死亡率和發病率正在上升〔13，14〕。高血壓作為世界上最常見的慢性病，長期飲酒在導致血壓升高的同時也會誘發肝臟疾病〔15，16〕。

在中國北方和寒冷地區的人群鹽攝入量高于南方和沿海地區，人群平均血壓及高血壓患病率也相應較高〔17〕。生活中高血壓多以繼發性為主，不良生活方式誘發為多。酒性濕熱，過量飲酒導致濕熱酒毒積累傷脾，濕熱濁邪留于肝臟，日久濕聚成痰，痰濁、濕熱與血相互搏結停于肋下而形成痞塊、瘀停水阻，而大腹如鼓，發為“酒臌”。長期飲酒型高血壓證候特征表現為“納呆少食”“身重腫滿”“體倦乏力”。過量飲酒致使酒精堆積傷及肝臟〔18〕。故從飲食角度研究并建立高血壓動物模型，對高血壓的預防和干預具有重要意義。

綜上，長期飲酒致高血壓可引起小鼠肝功能異常。單純飲酒誘導后隨著飲酒濃度的提升小鼠血壓升高明顯，持續、穩定的提升飲酒濃度可加速小鼠高血壓造模，通過自由飲酒造?？傻玫椒€定的高血壓小鼠模型，為治療飲酒致高血壓并改善肝臟損傷的藥物藥效學評價奠定基礎；為臨床針對長期飲酒致高血壓合并肝損傷病例的用藥、治療與深入研究提供思路。