內質網應激信號在姜黃素誘導Jurkat細胞凋亡中的作用

段園園 陳夢嬌 楊雪松 李晨陽 丁浩然 王銘暉 王弘珺

(吉林醫藥學院基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，吉林 吉林 132013)

急性T淋巴細胞白血病屬于惡性白血病〔1.2〕。臨床強化化療可以顯著提高急性T淋巴細胞白血病治愈率，但有效治療與靶向治療無效者或者同種干細胞移植失敗者預后較差，50%成年患者或15%～20%兒童患者或面臨死亡〔3〕。白血病與淋巴瘤細胞普遍存在基因表達異常和蛋白質翻譯增加的情況，增加的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白引起內質網應激(ERS)〔3，4〕。如果化療藥物提高腫瘤細胞ERS，將導致內質網穩態失衡促進腫瘤凋亡。本研究體外培養Jurkat細胞，重點關注姜黃素誘導ERS對Jurkat細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 實驗細胞系Jurkat由吉林大學第一醫院移植免疫學研究組提供；姜黃素、增強化學發光(ECL)液購自Sigma-Aldrich；甲基噻唑藍(MTT)溶液、PBS緩沖液購自寶泰克生物公司；RPMI1640購自Gibco；胎牛血清購自Biological Industries；Muse凋亡試劑購自Merck Millipore；葡萄糖調節蛋白(GRP)-78抗體購自Santa Cruz；C/EBP同源蛋白(CHOP)抗體購自Cell Signaling；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3抗體、Caspase4抗體和β-actin抗體購自SAB。

1.2Jurkat細胞培養 用含10%血清的RPMI1640(含雙抗)培養細胞，將細胞置于37℃、5%CO2的培養箱中，每2～3 d進行細胞傳代、換液。

1.3MTT比色法檢測Jurkat細胞存活與增殖 按照5×104細胞/孔接種Jurkat細胞于96孔板，設空白、陰性對照和不同濃度姜黃素組；細胞置于37℃培養12 h或24 h后，每孔加20 μl MTT溶液，再培養4 h；每孔加100 μl三聯液(10%十二烷基硫酸鈉，5%異丁醇，0.012 mol/L鹽酸)，培養12 h，適當振搖，加速結晶溶解；用Bio-Rad酶標儀在570 nm測定吸光度(A值)。計算增殖抑制率=1-(不同藥物孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)。

1.4流式細胞術檢測Jurkat細胞凋亡率 按照5×105細胞/孔接種Jurkat細胞于6孔培養板，設陰性對照和不同濃度姜黃素組；細胞置于37℃培養12 h；離心收集細胞；用含1%血清的RPMI1640培養液重懸細胞(密度1×106細胞/ml)；取等體積的細胞懸液與Muse 凋亡試劑，顛倒混勻，室溫避光放置20 min，在1 h內用流式細胞儀測定結果。

1.5Western印跡檢測內質網應激相關蛋白表達 按照2×106細胞/瓶接種Jurkat細胞，設陰性對照和不同濃度姜黃素組；細胞置于37℃培養12 h；離心收集細胞；用冰的PBS緩沖液洗滌細胞1次，離心收集細胞；加入100 μl RIPA蛋白裂解液(含1 mmol/L PMSF)，置于4℃靜止45 min，冰浴下超聲裂解細胞；12 000 r/min低溫離心5 min，取上清；Bradford法測定蛋白濃度。在樣品中加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣液，于100℃煮10 min。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，將樣品轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。先將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h；然后置于稀釋的一抗、4℃孵育過夜；次日用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)溶液漂洗PVDF膜5 min×3次；再置于稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗、室溫孵育2 h；用PBST溶液漂洗PVDF膜5 min×3次。吸去多余液體，每10 cm2膜加1 ml ECL工作液，放置1～2 min，將PVDF膜置于保鮮膜中，熒光成像儀檢測結果。用β-actin做內參，采用Quantity-one軟件分析結果。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗方差分析。

2 結 果

2.1姜黃素對Jurkat細胞生長的影響 將Jurkat細胞置于含0、5.0、7.5、10.0、20.0、30.0、40.0、60.0 μmol/L姜黃素的培養液中，培養12 h或24 h后，MTT比色法分析Jurkat細胞存活率。結果如圖1，姜黃素顯著抑制Jurkat細胞存活，抑制作用呈劑量與時間依賴性，12 h和24 h的IC50值分別為30.44 μmol/L和29.02 μmol/L。

圖1 姜黃素作用12 h和24 h對Jurkat細胞增殖的抑制作用

2.2姜黃素對Jurkat細胞凋亡的影響 隨姜黃素濃度增加，Jurkat細胞凋亡逐漸增加。姜黃素10.0 μmol/L、20.0 μmol/L組早期凋亡明顯高于對照組(P<0.01)；姜黃素20.0 μmol/L、30.0 μmol/L、60.0 μmol/L組晚期凋亡明顯高于對照組(P<0.001)，見表1；姜黃素30.0 μmol/L、60.0 μmol/L組主要為晚期凋亡，晚期凋亡占總凋亡的比率分別為81.63%、87.04%。

表1 各組細胞凋亡比率的比較

2.3姜黃素誘導Jurkat細胞凋亡的機制 隨著姜黃素濃度增加，活化Caspase3表達逐步增加，姜黃素30.0 μmol/L組活化Caspase3表達增加至對照組的11.9倍；活化Caspase4表達隨著姜黃素濃度增加而增加，姜黃素20.0 μmol/L組活化Caspase4表達增加至對照組的4.9倍，姜黃素30.0 μmol/L組活化Caspase4表達為對照組2.3倍。見圖2，表2。隨著姜黃素濃度增加，GRP78和CHOP表達增加，姜黃素20.0 μmol/L組GRP78表達量為對照組的2.6倍，CHOP表達量為對照組的4.8倍；姜黃素30.0 μmol/L組GRP78和CHOP表達量降低。見表2，圖3。

圖2 姜黃素對Jurkat細胞Caspase3、4的影響

表2 各組Caspase3和Caspase4及GRP78和CHOP表達水平的比較

圖3 姜黃素對Jurkat細胞內質網應激蛋白的影響

3 討 論

內質網由扁囊和小管構成，是維持細胞存活、調節細胞應激反應的重要細胞器，主要負責蛋白質的合成、修飾、折疊、轉運及鈣離子貯存和脂類合成。凡是影響內質網環境、擾亂內質網功能的因素將觸發內質網應激，例如缺氧、營養缺乏、氧化應激、鈣失衡及錯誤折疊或未折疊蛋白堆積等。腫瘤細胞本身存在內質網失衡、非折疊蛋白反應。大劑量化療增加未折疊蛋白反應，如果腫瘤細胞不能維持內質網穩態，將激活內質網應激反應、誘導細胞凋亡〔5〕。

姜黃素為天然抗腫瘤藥，能夠抑制乳腺癌、腦膠質瘤干細胞增殖，已經用于乳腺癌、結腸癌、胰腺癌的臨床治療試驗〔6～8〕，其主要作用機制為抑制腫瘤增殖、遷移與血管再生等。本實驗發現，姜黃素顯著抑制Jurkat細胞增殖，抑制作用具有明顯劑量依賴性和時間依賴性。姜黃素具有促進Jurkat細胞凋亡的作用。隨姜黃素濃度增加，活化Caspase3表達逐步增加，與流式分析結果同步，說明Jurkat細胞凋亡與姜黃素濃度相關。進一步發現，姜黃素作用后Jurkat細胞內質網應激相關凋亡蛋白Caspase4表達增加。姜黃素激活內質網應激上調GRP78、CHOP，通過活化內質網應激途徑誘導了Jurkat細胞凋亡。

姜黃素是多靶點抗腫瘤藥，在Jurkat細胞凋亡中，尚不清楚內質網應激信號與線粒體凋亡信號之間的關系。有研究表明內質網膜與線粒體外膜之間存在線粒體相關膜結構，存在Ca2+從內質網到線粒體的轉運〔9～11〕，內質網應激和線粒體凋亡信號之間或存在相互關聯。研究報道〔12～15〕，姜黃素誘導的腫瘤細胞凋亡與激活線粒體凋亡信號有關，姜黃素增加Jurkat細胞Bax表達，降低Bcl-2表達。在姜黃素誘導Jurkat細胞內質網應激時，是否內質網釋放Ca2+激活并促進線粒體凋亡信號加速Jurkat細胞凋亡，這尚需實驗證據。綜上，深入研究內質網應激與線粒體凋亡信號網絡在姜黃素誘導Jurkat細胞凋亡中的作用，將為解釋姜黃素的抗腫瘤機制以及治療急性淋巴細胞白血病提供新線索。