非小細(xì)胞肺癌組織中KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)及相關(guān)性

符芳永 林巍 盧偉 馬西淼

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院胸外科，海南 海口 570000)

肺癌的發(fā)病機(jī)制受環(huán)境、基因等多種因素影響。盡管隨著靶向藥物的出現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后得到了較大改善，但臨床療效及生存期僅發(fā)生在部分患者中〔1,2〕。因此，目前對非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志物進(jìn)行探索，能夠有效推進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的個體化治療，從而改善患者的預(yù)后效果〔3〕。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因蛋白(KISS-1)是人類最早從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移抑制基因，其與惡性腫瘤密切相關(guān)〔4〕。有臨床研究顯示，補體成分1q亞單位結(jié)合蛋白(C1QBP)在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)〔5〕。整合素α7(ITGA7)是整合家族中的一員，能夠與多種細(xì)胞外基質(zhì)層黏連蛋白結(jié)合發(fā)揮生理作用〔6,7〕。目前尚無有關(guān)KISS-1、C1QBP、ITGA7三者在非小細(xì)胞肺癌中的相關(guān)性研究，本文擬分析非小細(xì)胞肺癌組織中KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)及三者的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2017年4月至2020年4月中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者319例，均手術(shù)切除癌組織。其中男198例，女121例，年齡62～75歲，平均(68.5±5.2)歲；肺鱗癌201例，肺腺癌118例；病理分期：Ⅰa期58例、Ⅰb期76例、Ⅱa期68例、Ⅱb期77例、Ⅲa期22例、Ⅲb期16例、Ⅳ期2例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移167例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移152例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者符合中華醫(yī)學(xué)會放射腫瘤治療學(xué)分會對非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8〕；術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢測確診為非小細(xì)胞肺癌者；臨床病理治療保存完整；所有患者及家屬對本文研究知情，簽署知情通知書，通過我院倫理委員會認(rèn)可。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者在手術(shù)前接收到放、化療；合并其他惡性腫瘤者；手術(shù)后未保留癌組織樣本或病理資料不全者。

主要試劑：檸檬酸緩沖液(廠家：北京伊塔生物有限公司；貨號：SY3488)；中性甲醛(廠家：上海梵態(tài)生物科技有限公司，貨號：YT9186)；辣根過氧化物酶(廠家：北京澤平科技有限責(zé)任公司；貨號：MP 08364514)；蘇木素溶液(廠家：上海麥克林生化科技；貨號：G1142)。

1.2取材 手術(shù)切除非小細(xì)胞癌患者癌組織及癌旁組織進(jìn)行標(biāo)本制作，使用10%中性甲醛及4 μm防脫切片進(jìn)行連續(xù)切片，切片后作免疫組化檢測。

1.3免疫組化染色 對組織進(jìn)行連續(xù)切片后，加入檸檬酸緩沖液，放置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，隨后使用3%H2O2孵育，正常山羊血清封閉抗體，加入一抗后放置在4℃環(huán)境下過夜，次日滴加二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素溶液復(fù)染，脫水，晾干后使用中性樹膠封片。

1.4免疫組化結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果的判定根據(jù)細(xì)胞染色程度及細(xì)胞所占據(jù)面積進(jìn)行判定，染色強度：0分為不染色，1分為輕度染色，2分為中度染色，3分為強染色；染色面積：無細(xì)胞染色為0分，染色面積<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。細(xì)胞染色呈棕黃色點狀著色及細(xì)胞核著色計為陽性，兩種積分相加之和>2分為陽性，≤2分為陰性表達(dá)。

1.5KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)檢測 使用Western印跡檢測腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因蛋白KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)水平：對標(biāo)本以磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗后，行30 min裂解，后對蛋白濃度進(jìn)行測定。選擇20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加完成蛋白緩沖液后開始進(jìn)行10 min電泳，后將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%牛奶中，在常溫環(huán)境下進(jìn)行90 min封存。后結(jié)合一抗、稀釋，進(jìn)行1 d孵育，取出以TBST液沖洗，后結(jié)合二抗，保存60 min后開始清洗與顯色，對KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗、McNemar檢驗、χ2檢驗或Wilcoxon秩和檢驗及Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1癌組織及癌旁組織KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)對比 與癌旁組織相比，癌組織KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)較高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在肺癌組織中以棕黃色顆粒表現(xiàn)在胞質(zhì)內(nèi)，且在高表達(dá)的組織中細(xì)胞核內(nèi)也有所表達(dá)。見圖1，表1，圖2。

圖2 Western印跡檢測肺鱗癌中KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)

表1 癌組織及癌旁組織KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)對比

KISS

2.2KISS-1、C1QBP、ITGA7在臨床病理特征中的表達(dá) KISS-1、C1QBP、ITGA7在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；KISS-1、C1QBP、ITGA7高表達(dá)者多淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑更大；KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)與年齡、性別、分期、病理類型無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 KISS-1、C1QBP、ITGA7在臨病理特征中的表達(dá)(n,n=319)

2.3KISS-1、C1QBP、ITGA7表達(dá)相關(guān)性 KISS-1、C1QBP呈顯著正相關(guān)(r=0.238；P=0.002)；KISS-1、ITGA7呈顯著正相關(guān)(r=0.241；P=0.002)；C1QBP、ITGA7呈顯著正相關(guān)(r=0.206；P=0.007)。

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌中最常見的病理類型為肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌〔9,10〕。隨著我國工業(yè)的快速發(fā)展，其大氣污染物隨之增多，加重了肺癌的發(fā)展。早期非小細(xì)胞肺癌在臨床上的癥狀不明顯，且缺乏特異性特征，導(dǎo)致所屬患者發(fā)生時已然發(fā)展到了晚期，當(dāng)非小細(xì)胞肺癌發(fā)展到晚期后，會嚴(yán)重影響患者的生存情況〔11,12〕。

KISS-1作為人類最早從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移因子基因，其缺失表達(dá)與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔13,14〕。臨床研究指出KISS-1與惡性腫瘤密切相關(guān)，其在非轉(zhuǎn)移性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移性腫瘤中呈相反情況，其會出現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)，KISS-1在癌組織內(nèi)呈現(xiàn)出高表達(dá)，結(jié)果與上述結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，KISS-1與非小細(xì)胞肺癌有一定的關(guān)聯(lián)性，呈現(xiàn)出高表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中C1QBP表達(dá)呈現(xiàn)出高表達(dá)，且表達(dá)陽性程度與腫瘤直徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)聯(lián)性。原因可能是C1QBP能夠通過LICAM影響腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移，且能夠發(fā)揮出保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用〔16,17〕。有臨床研究顯示，C1QBP在惡性腫瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)，C1QBP與臨床惡性腫瘤密切相關(guān)〔18〕。研究顯示，C1QBP在增殖中增多，能夠通過綜合補體來防止宿主街道的細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從免疫系統(tǒng)中逃脫，增加存活的激活〔19〕。還有臨床研究指出，C1QBP在腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、血管生成中均有重要作用，以C1QBP為治療靶點，可以起到廣泛的抗腫瘤作用〔20〕。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，ITGA7在癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，且表達(dá)陽性程度與腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)聯(lián)。原因可能是ITGA7能夠通過調(diào)控多個信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和遷移等情況〔21,22〕。ITGA7能夠與整合素β1共同形成異二聚體，能夠參與對骨骼肌的完整性調(diào)控。有臨床研究顯示，與乳腺癌癌旁組織相比，ITGA7在癌組織中表達(dá)有所下降，且ITGA7能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移〔23,24〕。本研究發(fā)現(xiàn)，ITGA7或許在非小細(xì)胞肺癌中能夠起到促進(jìn)癌癥發(fā)展的作用。

但本研究中并未對KISS-1、C1QBP、ITGA7具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，且本次研究納入樣本量較少，且僅接納了手術(shù)切除患者，未納入不可手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者，因此，未能評估KISS-1、C1QBP、ITGA7在這一部分患者中的表達(dá)水平和臨床意義，且數(shù)據(jù)統(tǒng)計時可能存在一定偏倚，仍有待研究。本研究結(jié)果還說明KISS-1、C1QBP、ITGA7與非小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)，三者可能共同參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展演進(jìn)。