miR-324-5p通過靶向TRIP13基因調控宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡

郭紀芬 劉艷菊 孟芳

(1鄭州工業應用技術學院，河南 鄭州 451100；2鄭州大學第五附屬醫院婦產科)

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率和死亡率，嚴重威脅女性的生命健康〔1〕。近年來，宮頸癌發病呈上升及年輕化趨勢〔2〕。宮頸癌的治療方法主要有根治性手術、放療和化療。但是，晚期宮頸癌患者的治療療效不佳，預后較差〔3〕。從分子水平探討宮頸癌的發病機制，尋找有效的宮頸癌治療靶點具有重要的意義。微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，可在轉錄后調控基因的表達，參與生理和病理過程〔4〕。研究顯示，miR-324-5p在乳腺癌、肺癌、骨髓瘤等多種腫瘤中表達異常〔5～7〕，參與調控這些腫瘤細胞的惡性生物學行為。但是，miR-324-5p對宮頸癌細胞惡性生物學行為的影響和機制還未知。本研究主要探討了miR-324-5p對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1細胞和實驗試劑 正常宮頸細胞Ectl/E6E7和宮頸癌細胞Hela、C-33A、CaSki、SiHa購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清(FBS)購自杭州四季青；DMEM培養基，miR-324-5p 模擬物(mimics)及模擬對照序列(miR-con)、甲狀腺激素受體因子(TRIP)13小干擾RNA(si-TRIP13)及陰性對照序列(si-con)、TRIP13過表達載體(pcDNA-TRIP13)和空載體(pcDNA)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，日本TAKARA；引物序列由上海生工生物技術公司設計并合成；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜購自美國Sigma公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TRIP13抗體購自Abcam公司；Nanog、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化酶標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 復蘇Ectl/E6E7、Hela、C-33A、CaSki和SiHa細胞，均加含10%FBS的DMEM培養基，置于CO2培養箱中培養。每2 d更換一次培養基。待細胞生長密度達到80%左右時，0.25%胰酶消化進行傳代。將對數期各細胞均以每孔1.0×105個接種至6孔板中，培養24 h后，收集細胞，qRT-PCR檢測miR-324-5p和TRIP13 mRNA表達，Western印跡檢測TRIP13蛋白表達，選擇miR-324-5p和TRIP13表達較Ectl/E6E7細胞差異最顯著的宮頸癌細胞進行后續實驗。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-324-5p和TRIP13 mRNA表達 用Trizol試劑提取細胞中總RNA，逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環。miR-324-5p以U6為內參，TRIP13以β-actin為內參，采用 2-△△Ct法計算miR-324-5p和TRIP13 mRNA相對表達水平。

1.2.3細胞轉染 將對數期Hela細胞以每孔1.0×105個接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉染miR-con(miR-con組)、miR-324-5p mimics(miR-324-5p 組)、si-con(si-con組)、si-TRIP13(si-TRIP13組)、共轉染miR-324-5p mimics與pcDNA-TRIP13(miR-324-5p+pcDNA-TRIP13組)、miR-324-5p與pcDNA(miR-324-5p mimics+pcDNA組)。轉染6 h后，更換為含FBS的DMEM培養基繼續培養24 h。用qRT-PCR法檢測miR-324-5p或Western印跡檢測TRIP13蛋白表達驗證轉染效果。同時設置對照(NC)組，常規培養，不做任何處理。

1.2.4MTT檢測細胞增殖 將各組細胞以5×104個接種于96孔板中，分別培養12 h、48 h和72 h后，每孔加20 μl MTT(5 g/L)。繼續培養4 h后，棄上清液，每孔加150 μl二甲基亞砜溶液，室溫孵育5 min，混勻，于酶標儀490 nm處測定各孔的光密度(OD)值。

1.2.5Transwell檢測細胞遷移和侵襲 遷移實驗：將各組細胞用不含FBS的DMEM培養基重懸，取含2×105個細胞的細胞懸液加至Transwell小室的上室，500 μl含10%FBS的DMEM培養基加至下室。培養24 h后，將細胞用4%多聚甲醛固定15 min，0.2%結晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野對遷移細胞進行計數。侵襲實驗：首先在Transwell小室的上室鋪設基質膠。鋪設方法：使用不含FBS的DMEM培養基將液態基質膠原液稀釋8倍，取50 μl加入至上室，37℃凝固30 min。然后再將細胞懸液加至鋪有基質膠的上室中，剩余操作同遷移實驗。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 將各組細胞以每孔1.0×106個接種于6孔板中，培養24 h后，收集細胞。利用Annexin V-FITC/PI試劑盒操作檢測細胞凋亡。向每組細胞中加10 μl Annexin V，孵育10 min后，再加5 μl PI，孵育5 min后，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.7Western印跡檢測蛋白表達 將各組細胞以每孔1.0×106個接種于6孔板中，培養24 h后，收集細胞。加RIPA裂解液置于冰上裂解細胞，時間30 min。然后4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液(蛋白)。采用BCA蛋白試劑盒檢測提取的蛋白濃度后，取適量蛋白質，加上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性后進行十烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，再置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜后，分別用Nanog、Cyclin D1、MMP-2和Caspase-3一抗4℃孵育過夜。次日洗膜后，加入辣根過氧化酶標記的二抗37℃孵育2 h。再次洗膜后，加化學發光試劑避光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統曝光爆照。Image Pro Plus6.0軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.8雙熒光素酶報告基因實驗 將對數期Hela細胞以每孔1.0×105個接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別共轉染WT-TRIP13-3′ UTR與miR-324-5p mimics(或miR-con)、MUT-TRIP13-3′ UTR與miR-324-5p mimics(或miR-con)。轉染6 h后，更換為含FBS的DMEM培養基繼續培養24 h，裂解細胞。將裂解液離心(3 500 r/min、5 min)后，取20 μl上清液，加100 μl 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應工作液，檢測螢火蟲和海腎的熒光強度，以螢火蟲與海腎熒光強度的比值表示細胞熒光素酶活性。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1miR-324-5p和TRIP13在宮頸癌細胞系中的表達 與正常宮頸細胞Ectl/E6E7比較，宮頸癌細胞系Hela、C-33A、CaSki和SiHa中miR-324-5p表達明顯降低(P<0.05)，TRIP13 mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.05)。由于宮頸癌Hela細胞中miR-324-5p和TRIP13表達較Ectl/E6E7細胞差異最顯著，因此，選擇Hela細胞進行后續實驗。見圖1，表1。

圖1 宮頸癌細胞株中TRIP13蛋白表達

表1 宮頸癌組織中miR-324-5p和TRIP13的表達

2.2過表達miR-324-5p抑制宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲和遷移并誘導細胞凋亡 與miR-con組比較，miR-324-5p組Hela細胞中miR-324-5p表達明顯升高(P<0.05)，NC組miR-324-5p表達無顯著變化(P>0.05)，說明miR-324-5p mimics轉染成功。與miR-con組比較，miR-324-5p組Hela細胞48 h和72 h OD490 nm值、細胞遷移數和侵襲數均降低，凋亡率顯著升高，細胞中Nanog、CyclinD1和MMP-2蛋白表達顯著降低，Caspase-3蛋白表達明顯升高(均P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western印跡檢測相關蛋白的表達量

表2 轉染miR-324-5p對Hela細胞中miR-324-5p的相對表達量及細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

2.3miR-324-5p靶向TRIP13抑制TRIP13蛋白的表達 TargetScan生物信息學軟件預測顯示的TRIP13的3′UTR與miR-324-5p的結合位點見圖3。共轉染miR-324-5p mimics與WT-TRIP13-3′ UTR的細胞熒光素酶活性顯著低于共轉染miR-con與WT-TRIP13-3′ UTR的細胞(P<0.05)，而共轉染miR-324-5p mimics與Mut-TRIP13-3′ UTR的細胞熒光素酶活性與共轉染miR-con與Mut-TRIP13-3′ UTR的細胞比較無顯著變化(P>0.05)，見表3。miR-324-5p組Hela細胞中TRIP13蛋白表達低于miR-con組(0.52±0.04 vs 1.00±0.07，P<0.05)，anti-miR-324-5p組Hela細胞中TRIP13蛋白表達高于anti-miR-con組(1.78±0.13 vs 1.01±0.08，P<0.05)，見圖4。

圖3 TargetScan預測miR-324-5p靶向TRIP13

表3 miR-con或miR-324-5p與報告質粒共轉染Hela細胞后雙熒光素酶活性檢測

1～4：miR-con組，miR-324-5p組，anti-miR-con組，anti-miR-324-5p組

2.4沉默TRIP13抑制宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲和遷移并誘導細胞凋亡 與si-con組比較，si-TRIP13組Hela細胞中TRIP13蛋白表達降低(P<0.05)，NC組TRIP13蛋白表達無顯著變化(P>0.05)，說明si-TRIP13組Hela細胞中TRIP13沉默。與si-con組比較，si-TRIP13組Hela細胞48 h和72 h OD490 nm值、細胞遷移數和侵襲數均降低，細胞凋亡率顯著升高，細胞中Nanog、CyclinD1和MMP-2蛋白表達顯著降低，Caspase-3蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。見圖5，表4。

圖5 Western印跡檢測相關蛋白的表達量

表4 沉默TRIP13抑制宮頸癌Hela細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

2.5上調TRIP13逆轉過表達miR-324-5p對宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響 與miR-324-5p+pcDNA組比較，miR-324-5p+pcDNA-TRIP13組TRIP13蛋白表達顯著升高(P<0.05)，說明pcDNA-TRIP1轉染成功。與miR-324-5p+pcDNA組比較，miR-324-5p+pcDNA-TRIP13組Hela細胞48 h和72 h OD490 nm值、細胞遷移數和侵襲數均顯著增加，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，細胞中Nanog、CyclinD1和MMP-2蛋白表達顯著升高，Caspase-3蛋白表達顯著降低(均P<0.05)。見表5、圖6。

表5 上調TRIP13表達逆轉過表達miR-324-5p對宮頸癌Hela細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

1～4:miR-con組，miR-324-5p組，miR-324-5p+pcDNA組，miR-324-5p+pcDNA-TRIP13組

3 討 論

宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一，其治療效果較差〔8〕。miRNA可通過靶向靶基因的表達參與調控細胞的生物學行為，與腫瘤的發生發展密切相關，為腫瘤的治療提供了分子靶點〔9～11〕。

miR-324-5p在多種腫瘤中表達異常，參與腫瘤的發展進程。研究顯示，過表達的miR-324-5p通過靶向調節膠質瘤相關致癌基因(GLI)1抑制膠質瘤細胞的增殖〔12〕；miR-324-5p在肝細胞癌(HCC)細胞系和組織中表達下調，過表達miR-324-5p可能通過下調E26轉化特異性(ETS)1和特異性蛋白(SP)1抑制HCC細胞的侵襲和轉移能力，為侵襲性HCC治療提供了新思路〔13〕；過表達miR-324-5p通過靶向下調TSPAN8蛋白表達抑制胃癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡〔14〕；過表達miR-324-5p通過直接靶向ELAVL1表達抑制結腸直腸SW620和SW480細胞增殖和侵襲〔15〕。本研究結果說明過表達miR-324-5p抑制了Hela細胞的惡性行為，與相關研究報道的上調miR-324-5p可抑制宮頸癌細胞的集落形成、增殖、遷移和侵襲的結果一致〔16〕，提示miR-324-5p發揮抑癌基因參與宮頸癌的發展進程，其可能是宮頸癌的潛在治療靶點。

本研究證實了miR-324-5p在宮頸癌Hela細胞中靶向負調控TRIP13表達。TRIP13是甲狀腺激素受體因子13，基因定位于5p15.33，能夠編碼與甲狀腺激素受體相互作用的蛋白質〔17〕。研究顯示，TRIP13在多種腫瘤中表達異常，參與腫瘤的發生和發展。如TRIP13可促進體外結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲以及體內腫瘤形成，是結直腸癌的潛在生物標志物和治療靶標〔18〕。本研究結果提示通過抑制TRIP13表達可提高宮頸癌的治療療效。本研究結果還提示miR-324-5p通過調控TRIP13表達影響宮頸癌細胞的生物學行為。