異養硝化-好氧反硝化菌氮代謝機理的研究進展

趙天濤，陳沛沛，張 晟，封 麗

(1.重慶理工大學 化學化工學院， 重慶 400054；2.重慶市生態環境科學研究院， 重慶 400014)

水中含氮化合物超標會促進藻類等浮游生物的過度繁殖，引起水體富營養化，導致水質惡化，對生態環境以及人體健康造成嚴重威脅[1]。相比于物化法，生物脫氮由于經濟、高效、無二次污染等特點，被公認為是最有前途的脫氮方法[2]。傳統生物脫氮過程中，氨氮首先被自養硝化菌在好氧條件下轉化為硝態氮，然后由異養反硝化菌在厭氧或兼氧條件下將硝態氮還原為含氮氣體[3]。但是由于不同脫氮菌群的生理機制差異，導致硝化和反硝化過程在空間和時間上無法統一，造成系統水力停留時間長、抗沖擊負荷能力弱以及運行成本高等問題[4]。因此，開發新型生物脫氮工藝一直是廢水處理領域的熱點。

1983年，Robertson等[5]首次從廢水中發現了異養硝化-好氧反硝化(HN-AD)菌Paracoccuspantotrophus，并提出了異養硝化-好氧反硝化的概念。此后，研究者開展了大量HN-AD菌的分離鑒定工作，截至目前，約有20個屬近100多種HN-AD菌從環境中被分離出來[6]，如Acinetobactersp.SYF26[7]，PseudomonasmendocinaX49[8]，BacilluscereusGS-5[9]，AlcaligenesfaecalisWT14[10]，AnoxybacilluscontaminansHA[11]等。這類細菌在好氧條件下，可以快速將氨氮、硝態氮和亞硝態氮轉化為含氮氣體，且氨氮代謝過程中幾乎沒有硝態氮和亞硝態氮的積累[12]。較傳統脫氮微生物，HN-AD菌具有脫氮速率快、世代周期短等優勢，在實際廢水處理中可以簡化工藝流程，縮短水力停留時間，降低運行能耗。此外，基于HN-AD菌研發的生物膜技術可實現污泥近零排放，碳排放顯著降低[13]。

目前關于HN-AD菌的研究主要集中在菌株的分離鑒定、脫氮影響因素和關鍵酶分析等方面，相關的綜述也多是上述研究的概括與分析，而HN-AD菌具體的脫氮機制尚缺乏系統、清晰的認識和總結[14-16]。據此，對HN-AD菌相關研究開展了廣泛調研，并結合本課題組在HN-AD菌脫氮機理以及工藝方面的研究，從氮平衡角度對脫氮途徑進行了系統性分析，同時總結了HN-AD菌氮代謝作用相關酶系，對未來HN-AD菌的應用提出了展望，以期為此類菌脫氮機制的研究及在實際廢水處理中的應用提供參考。

1 HN-AD菌氮代謝途徑研究

HN-AD菌可以利用氨氮、亞硝態氮或硝態氮為氮源，通過同化作用(assimilation)轉化為細胞有機氮；也可以通過異化作用(dissimilation)將氮素轉化為含氮氣體(NO、N2O或N2)[17]。本文根據不同的氮源類型，對HN-AD菌的氮代謝途徑進行了總結。

1.1 HN-AD菌的氨氮代謝途徑

傳統的硝化細菌為自養型細菌，在硝化反應過程中有機物濃度不宜過高，否則會使異養細菌快速增殖，硝化細菌無法成為優勢菌屬，硝化反應無法進行[23]。而HN-AD菌的好氧同化過程可同時去除廢水中的有機物和氨氮。如陳均利等[24]在利用AlcaligenesfaecalisWT14處理實際養豬廢水時氨氮、硝態氮、總氮、COD平均去除率均在90%以上。譚俊杰等[25]發現菌株GNR在豬場廢水處理中，單位生物量COD和氨氮去除量最高可達129.73 mg/(L·g)。傳統硝化細菌和反硝化細菌生理機制的巨大差異使污水處理系統中本有的有機物無法被充分利用。如果硝化在前，反硝化過程中需要外加碳源；如果反硝化工藝段前置，則需要大規模回流硝化廢水，這些均不利于傳統生物脫氮工藝的高效運行[23]。HN-AD菌能夠解決這一難題，可以為一些高濃度有機廢水的脫氮除碳處理提供新思路和新菌源。

表1 不同HN-AD菌脫氮過程的氮平衡分析結果

1.2 HN-AD菌的硝態氮和亞硝態氮代謝途徑

表2 不同HN-AD菌脫氮過程的氮平衡分析結果

1.3 不同生物脫氮工藝氮代謝途徑比較

圖1 不同生物脫氮工藝的氮代謝途徑示意圖

2 HN-AD菌氮代謝作用酶系

HN-AD菌種屬多樣，在不同菌株中，氮代謝相關酶基因的表達存在較大差異，這也是造成氮代謝途徑有所不同的原因。參照傳統脫氮微生物并根據HN-AD菌的氮代謝產物可以推測，菌株氮代謝過程中可能涉及的酶有氨同化酶、氨單加氧酶、羥胺氧化酶、硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶[42]。

2.1 氨同化酶

氨同化的關鍵酶包括谷氨酸脫氫酶(glutamate dehy drogenase，GDH)、丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase，AlaDH)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)等[43]。谷氨酸脫氫酶分布廣泛，近年來許多關于谷氨酸脫氫酶的研究已經證明其主要以六聚體和四聚體2種形式存在。谷氨酸脫氫酶是谷氨酸合成的關鍵酶，也是HN-AD菌發揮同化作用的關鍵酶之一，在菌株ArthrobacterureafaciensCZ31[44]，Klebsiellasp.KSND[45]的氮代謝途徑中，都發現有谷氨酸脫氫酶的活躍作用。丙氨酸脫氫酶能夠催化丙氨酸與丙酮酸相互轉化，與氨基酸代謝和糖代謝有關，在維持生物體內氮平衡(固氮作用)中起重要作用[46]。谷氨酰胺合成酶是生物體中最古老、存在最廣泛的酶，可催化L-谷氨酸與L-谷氨酰胺的相互轉化，參與許多生物體的氮代謝和碳代謝[47]。

2.2 氨單加氧酶(AMO)

2.3 羥胺氧化酶(HAO)

2.4 硝酸鹽還原酶

2.5 亞硝酸鹽還原酶

2.6 NO還原酶及N2O還原酶

NO還原酶(NOR)可催化NO還原為N2O，在HN-AD菌中已有較多報導，如ExiguobacteriummexicanumSND-01[34]，BacillusthuringiensisWXN-23[58]等。NOR活性較強，使得NO一般不容易在系統中積累，避免了NO對微生物的毒性影響[59]。N2O還原酶(NOS)可以將N2O還原為N2。大多數HN-AD菌中分離得到的NOS都是可溶性的周質酶。如菌株Pseudomonas的NOS是由nosZ編碼的亞基組成的二聚體[60]。值得注意的是，N2O還原酶對氧氣敏感，控制適宜的溶解氧對N2O的還原至關重要[61]。

3 HN-AD菌氮代謝機理組學研究

HN-AD菌表現出的脫氮潛力和獨特代謝機制吸引了越來越多學者對這類微生物的關注。目前，組學技術正在成為研究生物體內分子的綜合方法[62]，包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學。應用組學技術可以從多個層次闡明HN-AD菌的氮代謝機理。例如，在以往的研究中，Peng Jin等[45]通過基因組學發現與HN-AD菌氮同化和異化途徑有關的基因，并利用實時定量PCR技術驗證分析了不同氮源下基因的變化水平。Ruan等[63]通過轉錄組分析發現了高、低不同硝酸鹽濃度下napA、nirS、norB、nosZ等反硝化基因表達的差異。碳源在好氧反硝化中起著重要作用，利用代謝組學可以分析不同碳源條件下好氧反硝化過程中關鍵代謝產物的變化[64]。據報道，鐵的添加可以增強HN-AD菌的脫氮性能[65]。然而目前鐵引發的機理尚不清楚，故Yang等[66]提出可以利用蛋白質組學來闡明鐵是否通過幫助合成某些反硝化酶的活性中心來促進好氧反硝化。

圖2 菌株TAC-1的氮代謝機制示意圖

4 結論

上述工藝研究在一定程度上豐富了HN-AD菌的研究范圍，但由于HN-AD菌的種類繁多，脫氮過程的酶系及其編碼基因存在差異，導致HN-AD菌脫氮途徑和機制尚不清晰，未來還需要更深入的研究和拓展，可以從以下4個方面進行：① 選擇模式菌株，全面深入地解析不同HN-AD菌屬的特征酶以及功能基因，通過酶的活性測定、分離純化、體外表達以及功能基因敲除等方法，推測HN-AD菌同步脫氮的途徑和機理；② 考察環境因子對HN-AD菌的影響，明晰菌體胞內生化反應的調節機制。通過設計正交實驗或響應面分析法尋找最優水平組合和工藝參數；③ 充分利用新一代高通量測序技術，如蛋白質組學、代謝組學等多組學測序對HN-AD菌進行分析，研究HN-AD菌基因表達水平和各種代謝路徑的底物和產物的小分子代謝物，從分子水平上推測其脫氮途徑及機制；④ 研究HN-AD菌在各類真實廢水中的作用，分析此類菌在氮循環過程中的地位以及如何優化工藝和條件參數使其成為優勢脫氮菌，加強HN-AD菌的實際應用研究。