同步異養硝化好氧反硝化細菌Acinetobacter sp.TAC-1的氮代謝途徑研究

高艷輝，譚 娜，趙天濤，，張云茹，張 千，彭緒亞，艾 鑠

(1.重慶大學 環境與生態學院， 重慶 400044； 2.重慶理工大學 化學化工學院， 重慶 400054； 3重慶士繼生態環境科技有限公司， 重慶 404100)

廢水的氮脫除工藝研究在世界范圍內一直備受關注，其中生物脫氮工藝被廣泛應用，目前主要分為傳統生物脫氮和新型生物脫氮工藝。傳統生物脫氮涉及硝化與反硝化作用2個反應過程[1-2]，它們分別由單一功能的好氧硝化細菌和厭氧反硝化細菌在不同反應器中或同一反應器不同時間獨立完成。傳統脫氮工藝成熟，但同時存在一些不足[3-9]：① 硝化細菌生物量低且增殖緩慢，對極端環境耐受性較差；② 硝化及反硝化過程由于氧氣需求的差別，需要單獨的構筑物，建設成本較高；③ 硝化過程產生酸度，需要投放堿以中和酸度，增加成本的同時提高了二次污染的風險。然而，細菌在單個細胞中可同時實現硝化和反硝化脫氮，比自養生物具有更高的生長速率和氮去除效率[10-11]，SND工藝在廢水脫氮領域展現了更強的競爭力。

多層面分析可以更好的揭示同步異養硝化-好氧反硝化代謝途徑。為清晰認識SND氮代謝途徑，采用具有SND功能的Acinetobactersp.TAC-1菌株開展研究：① 以TAC-1菌株為研究對象，對其異養硝化基因(hao)及好氧反硝化基因(nirS/nirK、narG/napA、norB及nosZ)進行DNA水平的PCR擴增與T-A克隆測序來定性分析脫氮途徑；② 通過T-A克隆構建所鑒定脫氮基因標準質粒，以其為模板建立TAC-1菌株SND過程脫氮基因的qPCR定量檢測方法；③ qPCR定量分析不同氮源培養條件下TAC-1菌株SND脫氮基因轉錄表達量的差異，并結合該菌株不同氮源培養條件下不同生長階段的氮代謝特性和產物分析共同揭示mRNA水平上TAC-1菌株SND氮代謝機制。該研究有助于更好的了解SND氮代謝機制，為SND脫氮工藝的開發和工程菌的構建提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和培養

本研究所使用菌株為一株具有高效低溫脫氮功能的不動桿菌Acinetobactersp.TAC-1，篩選自重慶某生豬養殖企業畜禽糞污沼液。將TAC-1菌株接種到高溫高壓滅菌的50 mL的肉湯培養基中富集，作為種子液。肉湯培養基(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5。異養硝化培養基：(NH4)2SO40.5 g/L，琥珀酸鈉 7.15 g/L，維氏鹽溶液 50 mL/L，調節pH值至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。其中維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO45.0，MgSO4·7H2O 2.5，NaCl 2.5，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·4H2O 0.05。亞硝酸鹽培養基：NaNO22 g/L，琥珀酸鈉 27.39 g/L，維氏鹽溶液 50 mL/L。硝酸鹽培養基：NaNO32.4 g/L，琥珀酸鈉 26.68 g/L，維氏鹽溶液 50 mL/L。

1.2 核酸提取和RT-PCR

取一定量培養到指數期的菌液，常溫離心獲得菌體，按照DNA提取試劑盒(型號：DP336，天根生化科技(北京)有限公司)說明提取樣品總DNA。取一定量培養到不同時期的菌液，低溫離心獲得菌體，按照RNA提取試劑盒(型號：DP419，天根生化科技(北京)有限公司)說明提取樣品總RNA。將提取的總RNA進行基因組DNA去除反應，以其為模版采用反轉錄試劑盒(型號：TSK301S，北京擎科生物科技有限公司)進行反轉錄(RT-PCR)合成cDNA，以cDNA為模版通過SYBR燃料法進行后續的qPCR實驗。

1.3 TAC-1菌株SND氮代謝基因PCR擴增和鑒定

以采用1.2小節方法提取獲得的TAC-1菌株的DNA為模版，根據文獻引物(表1)分別對TAC-1菌株SND氮代謝過程nirK、nirS、hao、norB、nosZ及narG基因進行終點PCR反應，經過對反應程序和反應體系的不斷優化，獲得nirS、narG、hao的反應體系為：上下游引物各2 μL、酶混合物25 μL、DNA 3 μL(小于500 ng)，用無菌無酶雙蒸水補足到50 μL；touchdown PCR反應程序為：98 ℃變性10 s，從65 ℃開始每個循環下降0.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，上述操作進行30個循環；然后繼續98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，上述操作進行44個循環，最后4 ℃保存。nirK基因的PCR反應體系為：上下游引物各1 μL、酶混合物25 μL、DNA 2 μL(小于500 ng)，用無菌無酶雙蒸水補足50 μL；PCR反應程序為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，上述操作進行44個循環，最后4 ℃保存。終點PCR引物序列見表1。擴增完成后，取5 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢測目的條帶分子量大小，然后切膠回收序列，使用對應片段的擴增引物對其進行測序，為了對測序序列進行鑒定和分析，將測序獲得的序列放入NCBI數據庫進行blast多序列比對分析，獲得與測序序列最相似的物種相似度，從中選擇相似度不同的參考序列與目標基因序列，基于目標基因序列同源性，使用Neighbor Joining法通過MEGA7構建系統發育樹(Bootstrap值為1 000次重復)，明確目標基因序列在屬水平上的進化關系。

表1 終點PCR及qPCR引物

1.4 TAC-1菌株SND氮代謝基因標準質粒構建

通過終點PCR獲取目標基因nirK、nirS及narG的擴增產物，電泳檢測目標基因條帶尺寸，并對大小合適的目標產物進行切膠回收，用于目標基因T-A克隆。目標基因的克隆方法如下：連接體系在室溫(22～30 ℃)放置1～5 min導入感受態細胞(型號：TSC01，北京擎科生物科技有限公司)中，冰浴25 min，42 ℃熱敷45 s，冰浴2 min，成為復蘇菌液，其在37 ℃，200 rpm的搖床中復蘇1 h后進行平板涂布，37 ℃過夜培養得到轉化子，連接體系為10 μL，根據基因片段長度加入相應量PCR產物，1 μL pClone007載體(型號：TSV-007，北京擎科生物科技有限公司)和1 μL 10× Topo Mix酶混合物，用超純水補足10 μL。

插入片段經凝膠純化后進行連接，通過PCR檢測排除其他污染可能性，檢測方法如下：用移液槍槍頭挑取白色透明單菌落至10 μL無菌水中，吹打混勻；取1 μL到20 μL Super PCR Mix(green)中輕微攪動，進行PCR檢測。PCR程序如下，98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s；58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s/kb；第二步循環35次后，4 ℃保存，PCR產物經電泳檢測后切膠回收，使用上游引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)及下游引物M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)進行測序，序列鑒定方法同2.3小節。根據公式(1)和(2)計算質粒中目標基因的濃度。

Y=X/M×6×1014

(1)

M=(Z1+Z2)×324

(2)

式中：X代表待測樣品濃度(ng/μL)，Y代表待測樣品拷貝數(copies/μL)，M代表樣本分子量，Z1和Z2分別代表載體和目標片段的堿基數。

1.5 基于mRNA差異表達的TAC-1菌株SND氮代謝途徑分析

1.5.1TAC-1菌株SND氮代謝基因qPCR

以重組質粒pClone007-nirK、pClone007-nirS、pClone007-narG為模板，進行qPCR定量實驗，優化后的qPCR引物序列見表1。將2.4小節獲得的單拷貝重組質粒依次進行10倍梯度稀釋，對每個基因的每對引物對應的qPCR反應體系進行退火溫度梯度優化，優化體系設置的退火溫度梯度范圍是53～68 ℃，由qPCR儀器自動平均分配為8個溫度梯度。nirK、nirS及narG基因的最優qPCR退火溫度分別為56.4 ℃、62.4 ℃及62.4 ℃。以上述10倍梯度稀釋的質粒作為構建qPCR標準曲線的模板，在最優的退火溫度條件下進行qPCR實驗，反應體系和反應程序參照試劑盒(型號：TSE201，北京擎科生物科技有限公司)，獲得對應標準曲線的方程，根據擴增效率E(80%～105%)和可決系數R2及擴增曲線和溶解曲線來對標準曲線進行質控分析，最后選擇各參數最優的標準曲線方程作為每個基因的qPCR定量檢測標準。nirK、nirS及narG基因標準曲線方程分別為方程(3)、(4)及(5)。nirK基因標準曲線質控參數為E=92.9%，R2=0.999，檢測限為：3.77～3.77×108copies/μL；nirS基因標準曲線質控參數為E=100%，R2=0.996，檢測限為：4.00-4.00×105copies/μL；narG基因標準曲線質控參數為E=93.5%，R2=0.998，檢測限為：3.10×101-3.10×106copies/μL。

Y=-3.504·log10X+38.416

(3)

Y=-3.321·log10X+37.825

(4)

Y=-3.4881·log10X+39.360

(5)

式中：Y代表nirK、nirS及narG基因qPCR過程中擴增曲線進入指數期的循環數，X代表樣品中nirK、nirS及narG基因的初始濃度(copies/μL)。

1.5.2TAC-1菌株SND氮代謝途徑分析

2 結果與討論

2.1 TAC-1菌株氮代謝途徑基因的鑒定

對TAC-1菌株的氮代謝調控基因nirK、nirS、hao和narG分別進行終點PCR實驗和電泳檢測，它們對應的電泳成像圖分別見圖1(a)和(d)。從圖1可看出，基因nirK、nirS、narG的DNA片段長度約為500 bp、900 bp/400 bp及600 bp，均與文獻[19-21]對應片段長度大致相符。其中將nirK基因和nirS基因的電泳產物分別切膠回收進行測序，獲得對應514 bp和849 bp/425 bp堿基序列。通過與NCBI數據庫的比對分析發現：nirK基因與Ochrobactrum屬菌株的序列覆蓋率范圍為94%～100%，相似度范圍為97.48%～98.64%。根據nirK基因對應的系統進化關系樹(圖2(a))發現其與Ochrobactrumanthropistrain YX0903的nirK基因序列最為接近，歸為一枝可信度為61，基因序列覆蓋度為100%，相似度為98.25%。在構建發育樹之前的參考序列篩選過程中發現NCBI數據庫中無法查詢到不動桿菌屬的nirK序列，盡管2013年Huang X F等[15]通過酶活性實驗證實了在不動桿菌Y16脫氮過程中硝酸鹽還原酶是與反硝化過程相關的一個關鍵酶，但是在不動桿菌的相關研究中并未有nirK基因的報道，基于以上分析推測不動桿菌TAC-1菌株的nirK基因可能是通過基因水平轉移獲得。

TAC-1菌株的nirS基因在后續對849 bp的片段(圖1(b))進行T-A克隆階段不成功，重新嘗試新的引物獲得的425 bp的序列(圖1(c))成功克隆獲得了nirS基因的標準質粒。TAC-1菌株的425 bp的nirS基因與Pseudomonasaeruginosa、Uncultured bacterium、Uncultured prokaryote、Burkholderiaceae bacterium、Wautersia、Ralstonia、Kocuriavarians、Cupriavidus等原核生物的對應序列覆蓋率范圍為90%～100%，相似度范圍為75.91%～99.02%。根據TAC-1菌株nirS基因的系統進化關系樹(圖2(b))發現其nirS基因與CupriavidusnecatorH16的nirS基因序列最為接近，歸為一枝可信度為99，基因序列覆蓋度為99%，相似度為99.02%。從系統進化關系亦知，TAC-1菌株的nirS基因遠離已報道不動桿菌屬菌株，其中基因序列與已報道不動桿菌菌株Acinetobacterhaemolyticusstrain ZYL、Acinetobacterseohaensisstrain WC_35及Acinetobacterbaumanniistrain 4300STDY7045820的覆蓋度范圍分別為0、70%及100%，相似度分別為0、72.76%及76.4%，與Acinetobacterhaemolyticusstrain ZYL未發現任何顯著相似性。推測不動桿菌TAC-1的nirS基因在適應環境過程中發生了基因突變及基因水平轉移。

根據文獻[21]中擴增菌株628 bp的narG基因所用引物擴增TAC-1菌株的narG基因，并進行凝膠電泳鑒定(圖1(d))測序，發現測序時引物和序列無法完整結合，只測出上游200 bp左右序列，這可能與narG序列自身特殊結構相關，NCBI比對結果證實：該序列確實為narG，要想測序獲得擴增片段的完整序列，須將該基因克隆之后再測序。因此通過3.2小節中T-A克隆獲得的標準質粒測序獲得TAC-1菌株narG基因序列，NCBI比對結果發現其與Aquaspirillum、Ralstonia，Uncultured bacterium clone、Chromobacterium、Aquitalea、Vogesella及Pseudogulbenkiania的序列覆蓋率范圍為99%～100%，相似度范圍為83.57%～86.5%。根據TAC-1菌株narG基因的系統進化關系樹(圖2C)發現其與Pseudogulbenkianiasp.NH8B的narG基因序列最為接近，歸為一枝可信度為59，基因序列覆蓋度為100%，相似度為86.5%。從系統進化關系亦知，TAC-1菌株的narG基因與已報道不動桿菌屬菌株存在一定距離，且narG基因在已報道的兩株不動桿菌Acinetobacterbaumanniistrain 4300STDY7045842和Acinetobacterseohaensisstrain WC_35之間也存在差異，歸為一枝的可信度僅為44。TAC-1菌株的narG基因序列與上述已報道的兩株不動桿菌菌株的覆蓋度范圍分別為24%和100%，相似度分別為79.25%及79.46%。此外，TAC-1菌株的narG基因與發育樹中進化關系較遠的MycobacteriumbovisBCG strain CaseA11、Uncultured bacterium clone soil.119、Uncultured bacterium clone soil.126及Staphylococcusaureus之間無顯著相似性。

對992 bp的hao基因擴增產物(圖1(e))進行測序，發現產物條帶位置遠低于992 bp，且序列無法與數據庫hao基因匹配，重新更換了不動桿菌屬特異擴增462 bp的hao引物[22]后，序列測序結果與不動桿菌屬基因組序列比對上，但是未對該基因命名。測序序列只有382 bp，與條帶位置不符(圖1(f))。后續對382 bp的序列進行T-A克隆，但是并不成功。hao基因與文獻報道[22]片段長度也不符。文獻[22]研究了該屬水平菌株的hao基因及推測的氨基酸序列，發現不動桿菌屬包含自養菌hao基因部分保守區域的ORF，但是這個ORF序列與已知自養菌的hao基因沒有明顯的相似性，其對應的氨基酸序列與已知異養菌的hao部分氨基酸序列也不完全相同，指出推測該屬水平菌株所含hao基因可能為一種新型羥胺氧化酶基因。由此推測：本研究所獲得的TAC-1菌株的hao基因亦可能為一種新型基因。此外在實驗過程中對整個代謝途徑的napA、norB、nosZ基因也分別進行了擴增，但始終無法通過優化反應條件擴增出這些片段，故推測該菌株可能不含有這幾種氮代謝基因。

基于以上分析，在DNA水平上初步推測了TAC-1菌株可能的異養硝化-好氧反硝化途徑，即兩種主導途徑均存在。但是與文獻報道[15,23]的不動桿菌屬的好氧反硝化基因(僅包含nirS基因，或nirK及nirS均無酶活)不同，該菌株同時含有兩個亞硝酸還原基因nirK及nirS，且硝酸鹽還原酶調控基因只含有narG，而非文獻報道的napA。

圖1 nirK、nirS、narG及hao基因PCR產物凝膠電泳成像示意圖

圖2 TAC-1菌株nirK(A)、nirS(B)及narG(C)基因的系統進化關系樹示意圖

2.2 不動桿菌TAC-1氮代謝基因標準質粒的構建

2.2.1nirK基因標準質粒構建

通過T-A克隆實驗獲得nirK克隆轉化子，搖菌后對菌液進行PCR擴增和電泳檢測，結果如圖3(a)，與marker對比發現nirK條帶約為500 bp；再取菌液提取連接質粒，進行PCR擴增和電泳檢測，結果如圖3(b)，與500 bp marker對比可見nirK條帶也約為500 bp。電泳產物切膠回收進行測序，獲得514 bp的nirK基因。從nirK克隆轉化子菌液中提取連接質粒，進行電泳檢測，結果如圖3(c)，與2000 bp marker對比可見2425 bp(nirK514 bp+pClone007 1911 bp)條帶。上述電泳結果表明：nirK標準質粒連接及導入成功。nirK克隆成功后，利用超微量紫外分光光度計對提取的克隆質粒“pclone007-nirK”進行濃度檢測，最終獲得1.74×1010copies/μL含有單拷貝nirK基因的標準質粒pClone007-nirK。獲得的標準質粒pClone007-nirK用于nirK基因qPCR檢測的標準曲線構建。

圖3 nirK克隆轉化子菌液PCR(a)、標準質粒PCR產物(b)及pClone007-nirK電泳圖(c)

2.2.2nirS基因標準質粒構建

對測序成功的849 bp的nirS基因回收產物進行T-A克隆，經過多種克隆載體嘗試，均不成功。更換nirSPCR引物后，獲得425 bp產物，經切膠回收，克隆，獲得單克隆平板，對轉化的21個克隆子進行搖菌培養，經過14～16 h培養后，對渾濁菌液進行菌液PCR和質粒PCR，獲得如圖4(a)～(b)所示產物條帶，對21個轉化子進行測序，均含有425 bp的nirS基因。對單克隆子擴大培養菌液進行質粒提取。利用超微量紫外分光光度計對待測樣品“pClone007-nirS”濃度進行檢測，獲得了濃度為1.10×1010copies/μL的pClone007-nirS標準質粒，用于nirS基因qPCR檢測標準曲線構建。

圖4 nirS克隆轉化子菌液PCR(a)、標準質粒PCR產物(b)電泳圖

2.2.3narG基因標準質粒構建

通過T-A克隆實驗獲得narG克隆轉化子，搖菌后對菌液進行菌液PCR擴增和質粒PCR，電泳檢測如圖4(a)～(b)。電泳產物切膠回收以引物M13F-R進行測序，獲得628 bp的narG基因。利用超微量紫外分光光度計對待測樣品“pClone007-nirS”進行檢測，獲得了濃度為3.10×1010copies/μL的pClone007-narG標準質粒，用于narG基因qPCR檢測標準曲線構建。

圖5 narG克隆轉化子菌液PCR(a)及標準質粒PCR產物(b)電泳圖

2.3 基于mRNA水平差異表達的TAC-1菌株SND氮代謝途徑分析

圖6 TAC-1在不同氮源培養條件下的脫氮特性、代謝產物和生長特性曲線

圖7 基于mRNA水平不同氮源培養條件下TAC-1菌株氮代謝基因差異表達圖

3 結論

1) 采用touchdown PCR及T-A克隆，結合凝膠電泳檢測和Sanger測序定性分析了不動桿菌屬Acinetobactersp.TAC-1在DNA水平上可能的SND氮代謝途徑，推測該菌株攜帶硝化過程的新型羥胺氧化酶調控基因；且反硝化過程亞硝酸還原酶調控基因nirK和nirS并存；此外菌株中還存在膜結合硝酸鹽還原酶調控基因narG，不存在周質硝酸鹽還原酶調控基因napA、一氧化二氮還原酶調控基因norB及一氧化氮還原酶調控基因nosZ。