富硒堇葉碎米薺中硒化合物的形態分析與鑒定

葉 梅，虞銳鵬，叢 欣，陳尚衛，朱 松*

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.恩施德源健康科技發展有限公司，湖北 恩施 445000）

硒是一種人體必需的微量元素，參與機體許多重要的代謝過程，適量的硒能起到抗氧化防御、維持氧化還原平衡作用，有效改善免疫系統功能［1-2］，降低患癌風險［3］；然而其不能在人體內自主合成，須通過外界攝入維持正常水平。硒在自然界中分為有機硒和無機硒：無機硒主要為Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ），對機體的安全閾值較低；有機硒包括硒蛋白、硒肽、硒代氨基酸等經代謝產生的一系列含硒化合物，對機體的安全閾值較高，生物利用度好［4］。因此，對于72%國土面積有不同程度缺硒的中國，科學安全高效地利用有機硒尤為重要［5］。

堇葉碎米薺是一種典型的富硒植物，能通過自身代謝途徑將無機硒高效地轉化為有機硒［6-7］，2020年國家衛生健康委員會已將堇葉碎米薺列為新食品原料。然而，目前對有機硒化合物的檢測手段大多是通過高效液相色譜-電感耦合等離子質譜（HPLC-ICP-MS）［8-9］和高效液相色譜-氫化物原子熒光光譜（HPLC-HG-AFS）分析幾種常見的硒代氨基酸［10-11］，這主要是受限于硒化合物標準品的數量與種類［12］。除此之外的未知硒化合物，必須采用液相色譜-高分辨質譜聯用方法進行結構鑒定［13-14］。

液相色譜-高分辨質譜聯用時常用的離子源為電噴霧電離（ESI）源，不受多原子干擾，可用于硒的特異性檢測，且高分辨質譜能很好地解決ICP-MS 受色譜分辨率限制而產生的共洗脫問題［13］。但隨著分辨率的提高，由于許多伴生的易電離物質產生干擾，使得硒化合物的信號受到強烈抑制，而背景值逐漸升高（相較于ICP-MS 高2 個數量級），導致靈敏度下降。這就需要通過多維色譜分離純化、凍干濃縮等步驟獲得較高濃度和純度的含硒化合物［15］。常用的高分辨質譜分析器主要包括飛行時間質譜（TOF MS）、軌道離子阱質譜（Orbitrap MS）和傅里葉變換質譜（FT-ICR-MS），其中Orbitrap MS 有利于對大分子量（500～1 000 Da）化合物的分析，但鑒定的硒化合物不夠全面［16-17］。FT-ICR-MS雖然具有極高的同位素保真度，但與液相色譜的兼容程度需進一步改善［13］。TOF MS在色譜模式下的高數據采集速度使其能與超高效液相色譜（UPLC）耦合，從而在相對復雜的樣品中檢測大量的含硒化合物，一定程度上彌補了ESI 離子源的不足，是有利于鑒定低分子量硒化合物的質譜儀器［13，18-19］。如Ward 等［20］將不同富硒酵母的硒化合物，經超濾膜過濾截取、凍干復溶后，直接進高效液相色譜-電噴霧電離源高分辨串聯質譜（HPLC-ESI Q-TOF MS），測定了超過100 種含硒化合物。目前運用液相色譜-高分辨質譜聯用鑒定的富硒樣品絕大多數是蛋白含量較高，研究較為透徹的富硒酵母，對富硒植物中硒化合物的研究較少。本文以富硒堇葉碎米薺為研究對象，在HPLC-ICP-MS 定量分析常見硒化合物的基礎上，通過3 kDa 超濾離心管去除大分子雜質、凍干濃縮等方法，采用超高效液相色譜-電噴霧電離源高分辨串聯質譜（UPLC-ESI-Triple TOF MS）實現了對富硒堇葉碎米薺中未知硒化合物的鑒定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

U3000 高效液相色譜儀、iCAP TQ 三重四極桿電感耦合等離子質譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；SCIEX ExionLC?AC超高效液相色譜、X500R Triple TOF MS 高分辨質譜（美國AB SCIEX 公司）；恒溫金屬浴磁力攪拌器（德國IKA 公司）；5804R 臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Mars6 微波消解儀（美國CEM 公司）；LE204E 分析天平、FiveEasy Plus pH 計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；3 kDa 超濾離心管（15 mL，美國Millipore 公司）；冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TechMate C18-ST 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，日本Shiseido 公司）；Kinetex F5 超高效液相五氟苯基柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國Phenomenex公司）。

標準溶液：硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）（中國計量科學院國家標準物質研究中心）；富硒堇葉碎米薺干粉（恩施德源健康科技發展有限公司）；堿性蛋白酶（諾維信生物技術有限公司）；胰蛋白酶、蛋白酶K（合肥博美生物科技有限責任公司）；磷酸氫二銨、10%四丁基氫氧化銨水溶液（國藥集團化學試劑有限公司）；硝酸、甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，美國Tedia公司）。實驗所用超純水由Milli-Q系統（電阻率為18.2 MΩ·cm，美國Millipore公司）制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 ICP-MS 測定總硒 取0.15 g富硒堇葉碎米薺干粉于微波消解管中，加3 mL 硝酸，冷消化過夜后加入5 mL 水，于微波消解儀中消解2 h。將消解后的溶液用水定容至相應體積，充分搖勻。取約15 mL，過0.22 μm尼龍膜，于4 ℃保存待測。樣品平行實驗3次，同時做試劑空白。

1.2.2 HPLC-ICP-MS 測定硒形態 混合硒標準溶液的配制：分別準確吸取466.5 μL Se（Ⅳ）、482.0 μL Se（Ⅵ）、575.0 μL MeSeCys、452.5 μL SeCys2、507.5 μL SeMet溶液，用水定容于10 mL容量瓶中，得質量濃度為2.0 mg/L的硒化合物儲備液（以硒計）。混合配制成200 μg/L的混合標準溶液（以硒計），置于4 ℃冰箱保存。

樣品前處理：稱取0.1 g 富硒堇葉碎米薺干粉，經5%堿性蛋白酶-胰蛋白酶-蛋白酶K 酶解后，400 r/min磁力攪拌4 h。4 ℃下以4 000 r/min離心30 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣。

HPLC條件：色譜柱為TechMate C18-ST反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為30 mmol/L磷酸氫二銨、0.5 mmol/L四丁基氫氧化銨、3%甲醇，以10%甲酸調流動相pH為6.0。柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。進樣量為10 μL，分析時間為10 min。

ICP-MS條件：射頻功率為1 550 W，冷卻氣流量為14 L/min，輔助氣流量為0.8 L/min，霧化氣流量為1.025 L/min，O2流量為0.326 mL/min，泵轉速為40 r/min，測定模式為TQ-O2模式，Q1設置分析質量數為m/z=80，Q3設置質量數為m/z=96。

1.2.3 UPLC-ESI-Triple TOF MS 測定未知硒化合物 樣品前處理：將0.5 g 富硒堇葉碎米薺干粉經酶解后，離心取上清液過15 mL 3 kDa 超濾離心管，4 000 r/min 離心2 h，-20 ℃冷凍干燥后，以1 mL初始流動相復溶，4 ℃下以14 000 r/min高速離心5 min，取上清液待檢測。

UPLC 條件：Kinetex F5 超高效液相五氟苯基柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫為40 ℃，進樣盤溫度為4 ℃。流動相：A 為0.1%（體積分數，下同）甲酸-水溶液，B 為0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，3% B；1～15 min，3%～95% B；15～18 min，95% B；18.1～20 min，95%～3%B。流速為0.3 mL/min，進樣量為10 μL。

ESI-Triple TOF MS 條件：電噴霧（ESI）正離子源，氣簾氣（CUR）為241 kPa；霧化氣（GS1）為379 kPa；輔助氣（GS2）為379 kPa；噴霧電壓（ISVF）為5 500 V；離子源溫度（TEM）為550 ℃，IDA 模式下設置去簇電壓（DP）為60 V，碰撞電壓（CE）為35 V，碰撞電壓差（CES）為15 V。

2 結果與討論

2.1 富硒堇葉碎米薺中總硒及已知硒形態的含量

采用ICP-MS 測得富硒堇葉碎米薺的總硒含量為2 853.5 mg/kg；經復合蛋白酶酶解后，采用HPLC-ICP-MS進行形態分析，外標法定量計算該堇葉碎米薺中5種硒形態SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）的含量分別為2 154.1、18.5、225.8、4.5、52.3 mg/kg。結果表明，該堇葉碎米薺中主要硒形態為有機硒（以SeCys2為主），有機硒含量達到總硒含量的76.3%。混標和富硒堇葉碎米薺的HPLC-ICP-MS 圖如圖1所示，可見該堇葉碎米薺中存在多種微量的未知硒化合物，需進一步采用高分辨質譜分析鑒定。

圖1 200 μg/L混標（以硒計）（A）和富硒堇葉碎米薺（B）的HPLC-ICP-MS圖Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatograms of 200 μg/L（as Se）mixed standard solution（A）and Se-enriched C. Violifolia（B）peak：1. SeCys2；2. MeSeCys；3. Se（Ⅳ）；4. SeMet；5. Se（Ⅵ）

2.2 富硒堇葉碎米薺中未知硒化合物的鑒定

2.2.1 數據依賴型掃描和動態背景扣除

Triple TOF 高分辨系統的采集速度高達100 Hz，采用數據依賴型掃描（IDA）［21］和動態背景扣除（DBS）的數據采集模式，能夠使濃縮復溶后的堇葉碎米薺樣品經一次進樣后同時獲得高質量的全掃描TOF MS譜圖和全面的TOF MS/MS譜圖。其中TOF MS譜圖的掃描范圍為m/z100～1 000；IDA模式選擇獲得15個產物離子的TOF MS/MS 譜圖，掃描范圍為m/z50～1 000。DBS可以過濾干擾雜質，在通過高分辨和精確質量數全掃描發現主要化學成分的同時，保證目標物得到高質量的TOF MS/MS 譜圖，這些高分辨率和精確質量數譜圖可用于對目標物的主要化學成分進行結構闡明與確證。

2.2.2 同位素過濾和質量虧損過濾

硒是一種同位素分布特征明顯的元素。本實驗結果顯示，硒有6個同位素峰，74Se同位素峰的豐度非常小，僅占最高豐度80Se 的1.79%。而76Se、77Se、78Se、80Se、82Se 同位素的豐度比約為19∶15∶48∶100∶18，可利用該特征通過同位素過濾方法挖掘數據，找到符合硒同位素分布的質譜圖，進而找到可能的含硒有機物。對于可能含有2～3個硒的有機小分子物質，則須先通過元素組成計算工具Mass Calculators得到不同的硒同位素分布情況，再進行同位素過濾。需要注意的是，由于有時譜圖干涉或同位素強度比缺乏保真度，須通過人工處理進行再次確認［13］。

另外，硒的質量虧損約為921 mDa，與常見元素有一定差異，因此也可利用特征質量虧損過濾進行含硒有機物的確認［18］。

2.2.3 硒化合物分子式的確認及結構鑒定

依據上述步驟，除HPLC-ICP-MS 形態分析的5 種硒化合物外，本實驗通過UPLC-ESI-Triple TOF MS 鑒定［22］出15 種硒化合物，其中有7 種已被報道（如表1）。在8 種未報道的硒化合物中，提出了3 種硒化合物的結構式，分別為C4H7NO2Se（［M +H］+的m/z為181.971 5）、C5H8O2Se（［M +H］+的m/z為180.976 2）、C7H9NO2Se（［M+H］+的m/z為219.987 4），詳細的質譜和結構特征信息見表2。以下是3種硒化合物結構的鑒定過程。

表1 富硒堇葉碎米薺中鑒定的15種硒化合物Table 1 Se compounds identified in Se-enriched C. Violifolia

表2 富硒堇葉碎米薺中鑒定出的硒化合物的一級和二級質譜信息Table 2 MS and MS/MS informations of Se compounds identified in Se-enriched C. Violifolia

2.2.3.1 C4H7NO2Se 通過同位素過濾和質量虧損過濾，在保留時間3.05 min 位置，找到m/z為181.971 5 的化合物加氫母離子，其同位素分布和質量虧損符合硒化合物的特征，提取離子流（XIC）圖和TOF MS 譜圖分別見圖2A、B。為進一步確認該化合物的元素組成，將其TOF MS 譜圖與Formular Finder的MS Details相鏈接，基于其精確質量去除大量元素組成，設置最大元素組成為C50H200N10S5Se5以過濾最大和最小的潛在原子數量和原子類型，留下可能的元素組成形成元素組成列表。根據MS Rank 和Δppm（化合物母離子的精確質量數和理論質量數的偏差）對所有可能的結果進行排序，Δppm 越小，表明提出的m/z與精確的單同位素質量越接近，元素組成的可信度越高。另外，還需考慮元素組成的不飽和度（RDB值）是否符合組成化合物的規律。結果表明，該化合物的分子式僅有1 種元素組成為C4H7NO2Se，Δppm 為0.1 ppm，RDB 值為3，可信度較高，又由于該化合物的m/z值相對較低，分子組成簡單，其元素組成可以確定。根據Far等［15］的報道，該化合物的M+H 峰在富硒酵母中被鑒定為某些化合物的裂解產物，對應于硒同型半胱氨酸（SeHCys）的源內片段，如圖2C的結構圖所示。TOF MS/MS譜圖（圖2C）通過Formular Finder擬合得到的分子組成與一級質譜完全一致，MS Rank 和MS/MS Rank 均為1 時，其一級質譜Δppm 為0.6 ppm，RDB 值為3，二級質譜Δppm 為3.8 ppm。TOF MS/MS 譜圖中響應值最高的m/z135.966 4 峰對應的裂解片段為C3H6NSe，為母離子失去羧基（—COOH）后形成碳碳雙鍵（C====C）所得，與Far［15］和Ouerdane［16］的報道一致。且二級質譜擬合出的其他可能的碎片CHSe、C2H5Se等也證實了該結構的合理性。

圖2 硒化合物C4H7NO2Se的XIC圖（A）、MS圖（B）、MS/MS圖和結構式（C）Fig.2 Extracted ion chromatogram（XIC，A），MS spectrum（B），MS/MS spectrum and putative chemical structural formula（C）of Se compound C4H7NO2Se

2.2.3.2 C5H8O2Sem/z為180.976 2的峰經同位素過濾和質量虧損過濾后，通過人工驗證確認為硒化合物，其保留時間為1.24 min，XIC圖和相應TOF MS譜圖如圖3A、B所示。通過Formular Finder模式，發現該峰為某含硒化合物的M+H 峰，基于該M+H 峰的精確質量數和最大元素組成擬合形成其所有可能的元素組成列表。根據MS Rank 和Δppm 對所有可能的元素組成進行排序，當元素組成為C5H8O280Se時，其MS Rank 為1，Δppm 為-0.2 ppm，RDB 值為3；當元素組成為C5H8O278Se 時，其MS Rank 為1，Δppm 為0.5 ppm。該化合物的母離子在同位素80Se 和78Se 的精確質量數與理論質量數偏差均小于5 ppm，同位素豐度之比為100∶45.3，與理論離子比例偏差小于10%，表明該化合物的元素組成很可能為C5H8O2Se，但由于其元素組成列表還有其他可信度較高的可能性，最終分子式須通過TOF MS/MS譜圖進一步確證。

圖3 硒化合物C5H8O2Se的XIC圖（A）、MS圖（B）、MS/MS圖和結構式（C）Fig.3 Extracted ion chromatogram（A），MS spectrum（B），MS/MS spectrum and putative chemical structural formula（C）of Se compound C5H8O2Se

該前體離子（m/z為180.976 2）相應的TOF MS/MS譜圖如圖3C所示，其多數碎片離子符合硒同位素分布模式，為含硒裂解碎片。將TOF MS/MS 譜圖與Formula Finder 的MS/MS Details 相鏈接，基于二級質譜擬合出可能的母離子分子式和碎片分子式。結果表明，MS Rank 和MS/MS Rank 均為1 時，其一級質譜Δppm 為-0.2 ppm，RDB 值為3，二級質譜Δppm 為5.5 ppm，分子式與一級質譜擬合出的分子式完全一致，可以推測該化合物的分子式極有可能為C5H8O2Se。

該化合物的前體母離子進一步裂解后可能產生的碎片離子如表2 所示，根據Ward 等［20］的報道和SeMet 標樣的二級譜圖，相似的裂解碎片CH3Se、C2H5Se、C4H7Se 表明該化合物很可能為SeMet 的前體離子（C5H12NO2Se+）失去NH4+后的產物。其次，裂解碎片C4H7O2為Ouerdane 等［24］報道的2 種甲基硒碳水化合物M+H 峰的前體母離子C5H11O3Se+、C6H13O3Se+的裂解碎片，推測該硒化合物的母離子C5H9O2Se+為甲基硒碳水化合物的母離子C5H11O3Se+中性丟失H2O 分子，產生的一種新的甲基硒碳水化合物（Methylseleno carbohydrate），進一步驗證了該化合物的結構。將該化合物的結構式導入ChemDraw，通過Show Analysis Window 分析可能的裂解碎片與TOF MS/MS譜圖是否一致，結果表明該結構式滿足該化合物的多數裂解碎片，如CH3Se、C2H5Se、C4H7Se、C4H5O2、C4H7O2，最后通過Check Structure 功能驗證了該化合物結構式的合理性。該甲基硒碳水化合物可能的化學結構式及裂解過程如圖3C所示。

2.2.3.3 C7H9NO2Se MS 質譜圖中，在m/z為219.987 4 處，發現符合硒同位素分布特征的硒化合物母離子，在總離子流（TIC）圖中，其保留時間為3.79 min。該硒化合物母離子在m/z219.987 4 處的同位素分布XIC 圖及相應TOF MS 譜圖見圖4A、B。經Formula Finder 進行分子擬合后，結果表明元素組成為C7H9NO2Se 時，其MS Rank 為1，Δppm 為1.2 ppm，RDB 值為5，符合基本的化合物元素組成規律。該母離子經二級裂解后產生的TOF MS/MS 譜圖如圖4C 所示。基于TOF MS/MS 進行Formula Finder分子擬合，擬合出的分子式中，MS Rank 為1，MS/MS Rank 為1 的元素組成與TOF MS 譜圖擬合結果一致，其一級質譜Δppm 為1.2 ppm，二級質譜Δppm 為1.6 ppm，RDB 值為5，是一個多不飽和硒化合物。

圖4 硒化合物C7H9NO2Se的XIC圖（A）、MS圖（B）、MS/MS圖和結構式（C）Fig.4 Extracted ion chromatogram（A），MS spectrum（B），MS/MS spectrum and putative chemical structural formula（C）of Se compound C7H9NO2Se

在TOF MS/MS 譜圖中，m/z173.981 7 為響應強度最高的碎片，其響應強度達到2×104，符合硒的質量虧損特征，表明該硒化合物經二級裂解最可能形成m/z173.981 7 的含硒裂解碎片離子，其擬合出的分子式為C6H8NSe，與硒化合物C7H9NO2Se相比，質量數減少了46 Da，表明該化合物很可能含有1個羧基（—COOH），通過中性丟失失去1 個CO 和1 個H2O，由于該化合物的不飽和度較高（RDB 值為5），存在C6H9NSe、C4H5Se、C3H7Se等裂解碎片，表明該硒化合物存在1個環狀結構且含有2個C====C鍵；其次，許多裂解碎片的m/z值較大，表明該硒化合物的硒存在于環狀結構中。據此，通過ChemSpider 找出最可能的硒化合物為硒代苯基丙氨酸（Seleno-phenyl-alanine），導入ChemDraw，嘗試斷裂可能的鍵，通過Show Analysis Window 得到可能的碎片并與TOF MS/MS譜圖擬合出的碎片相匹配，推測硒代苯基丙氨酸可能的結構及裂解途徑如圖4C所示。

3 結 論

本文采用HPLC-ICP-MS對富硒堇葉碎米薺酶解液中的5種硒形態進行了定量分析；將酶解液通過3 kDa 超濾管去除大分子物質和純化后，冷凍干燥濃縮樣品中的硒化合物，避免了復雜的多維色譜純化過程；結合UPLC-ESI-Triple TOF MS 高分辨質譜鑒定出富硒堇葉碎米薺中15 種未知硒化合物，包括7種已報道和8種未報道的硒化合物，提出了3種未報道硒化合物的可能結構式。鑒定策略為：通過硒的同位素分布和質量虧損特征發現含硒化合物后，利用含硒化合物的MS、MS/MS 譜圖和Formula Finder 擬合出可能的含硒化合物分子式，再通過ChemSpider 及文獻搜索，找到可能的含硒化合物結構式，最后根據硒化合物的MS、MS/MS 譜圖和裂解碎片采用ChemDraw 驗證硒化合物結構式的可靠性。本研究為富硒植物中硒形態分析及未知硒化合物鑒定提供了思路。