超高效液相色譜-串聯四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜法測定豆類中的硒代蛋氨酸

賈 瑋，馬如甜，代春吉，石 琳，莫海珍，2，張 浩，夏曾潤，祁 蒙

（1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安710021；3.河南科技學院 食品學院，河南 新鄉 453003；4.安康市富硒產品研發中心，陜西 安康 725000）

硒元素（Se）是人體正常生長發育過程中所必需的微量營養元素，通過參與谷胱甘肽氧化酶作用而發揮抗氧化、抗衰老、拮抗有毒有害金屬、預防心血管疾病等多種重要的生理調節功能［1-3］。缺硒會導致機體功能障礙，引發各種疾病，如克山病和免疫缺陷疾病等［4-6］。“土壤-植物-機體”循環是人體獲取硒的主要途徑，植物源食品中的硒形態復雜，分為無機硒和有機硒，硒的不同形態直接影響食品的營養價值及安全性。隨著富硒食品中有機硒含量的增加，硒的營養吸收及轉化率逐漸增加［7］。植物源食品中有機硒形態包括：硒代氨基酸、硒蛋白、硒多糖、硒多酚等。富硒豆類的種植是富硒產業全產業鏈高質量發展的重要抓手，作為豆類中有機硒的重要組成，硒代氨基酸的準確定量分析是相關產品精深加工過程中質量控制的關鍵。

硒代氨基酸的檢測方法主要為高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法［8-10］、高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法［11-13］與高效液相色譜-串聯質譜法［14-17］。前兩種方法均是將富硒食品中硒代氨基酸經強酸消解轉化為無機硒，通過與標準物質的保留時間比對實現硒形態的鑒定，無法直接提供有機硒形態結構信息［18］。硒代氨基酸主要包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸等，其中硒代蛋氨酸是目前已知生物利用率最高的硒化合物。已有研究者采用高效液相色譜-串聯質譜法對綠豆芽、大豆、麥麩中的硒代蛋氨酸進行了檢測，但均是使用三重四極桿質譜，分辨率較低。本研究基于超高效液相色譜-串聯四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜的數據依賴型掃描模式，建立了豆類中硒代蛋氨酸（SeMet）的檢測方法，優化了超高效液相色譜條件及樣品前處理條件，并對硒代蛋氨酸的碎裂途徑與機理進行了研究。該方法操作簡便，分辨率高，準確性及重復性好。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

綠豆（陜西西安，超市）；富硒綠豆、富硒黑豆、富硒紅豆（陜西安康，湖北恩施）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純，上海山浦化工有限公司）；濃鹽酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；胰蛋白酶、蛋白酶K（Sigma Aldrich 公司）；0.22 μm 微孔濾膜（美國Pall 公司）；乙腈、甲酸、甲酸銨、乙酸、乙酸銨（色譜純，美國Sigma 公司）；硒代蛋氨酸標準物質（CAS號：3211-76-5，純度＞97.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

Avnti J-26×PI 型高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter 公司）；Vortex.Genie2T 型旋渦混合器（美國Scientific Industries 公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；AL204-IC 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SHZ-A 型水浴恒溫振蕩器（上海躍進醫療器械有限公司）；Ultimate 3000-Q-Exactive 型超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道離子阱質譜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Milli-Q Integral型純水儀（美國Millipore公司）。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取硒代蛋氨酸標準品1.0 mg（精確至0.01 mg）于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈-水溶液（1∶1，體積比）溶解并定容至刻度，得到100 mg/L 的標準儲備液，于棕色密閉瓶-20 ℃避光保存。準確移取一定量的標準儲備液，用乙腈-水溶液（1∶1）稀釋，配制一系列質量濃度的標準溶液。取空白樣品，經前處理后得到基質提取溶液，用其逐級稀釋硒代蛋氨酸標準儲備液，得到一系列質量濃度的基質匹配標準溶液。實驗所用標準溶液均現用現配。

1.4 樣品前處理

準確稱取粉碎后的樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入10 mL Tris-HCl（30 mmol/L，pH 7.5）緩沖溶液，渦旋混勻，水浴超聲30 min，加入10 mg胰蛋白酶，37 ℃恒溫水浴振蕩酶解4 h，然后加入10 mg 蛋白酶K，50 ℃恒溫水浴振蕩酶解4 h，在4 ℃條件下，10 000 r/min 離心20 min。取上清液于離心管中，加入等體積的乙腈，靜置10 min 后以10 000 r/min 離心20 min（4 ℃），取上清液，用乙腈-水溶液（1∶1）按體積比1∶3稀釋，過0.22 μm微孔濾膜后上機測定。

1.5 分析條件

色譜條件：Hypersil GOLD HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，1.9 μm，美國Thermo Fisher Scientific 公司），流動相A：0.2%（體積分數，下同）甲酸6 mmol/L甲酸銨水溶液，流動相B：0.2%甲酸6 mmol/L甲酸銨乙腈溶液，pH值為2.86；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。梯度洗脫程序：0～2 min，95%～80%B；2～4 min，80%～60%B；4～8 min，60%B；8～9 min，60%～95%B；9～10 min，95%B。

質譜條件：電噴霧離子化（ESI），采用正模式；鞘氣流速：18 L/min，輔助氣流速：3 L/min；毛細管電壓：正離子模式3 500 V；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：320 ℃。全掃描模式（Full scan）下，分辨率為70 000 FWHM，自動增益控制的目標值（AGC）為1.0×106，掃描范圍為m/z70～400，最大注入時間為100 ms。二級掃描方式為全掃描/數據依賴掃描模式（Full MS/dd-MS2），分辨率為35 000 FWHM，自動增益控制的目標值為1.0×105，觸發時間（Apex trigger）為3～6 s，動態背景扣除為10.0 s，選擇TOP 5 模式。待碎裂的目標分析物相關信息在Inclusion list 中設定，保留時間為4.11 min，質荷比為198.002 78，當待碎裂的離子響應強度達到強度閾值2.9 × 104時，即送往高能碰撞解離池（HCD），在碰撞能量10 eV條件下進行碰撞，得硒代蛋氨酸碎裂片段的質荷比為180.976 46、151.997 53。

2 結果與討論

2.1 超高效液相色譜條件的優化

本實驗選擇Hypersil GOLD 柱（100 mm × 2.1 mm，5 μm）和Hypersil GOLD HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，1.9 μm）兩種不同選擇性的色譜柱進行硒代蛋氨酸的分離。Hypersil GOLD 色譜柱的固定相為鍵合長鏈烷基的多孔硅膠，載碳量為10%，疏水性較強；Hypersil GOLD HILIC 色譜柱的固定相為強親水性的極性吸附劑，載碳量為6%。結果表明，Hypersil GOLD HILIC 色譜柱對硒代蛋氨酸的保留能力比Hypersil GOLD 色譜柱強，且目標化合物的色譜峰響應值較Hypersil GOLD 色譜柱高（圖1）。因此，本實驗選擇Hypersil GOLD HILIC色譜柱做進一步的優化實驗。

圖1 硒代蛋氨酸經不同色譜柱及流動相分離的色譜峰響應值（n=6）Fig.1 Peak response values of selenomethionine separated by different chromatographic columns and mobile phases（n=6）

流動相攜帶待測物質經色譜柱分離后進入質譜，在去溶劑的同時形成帶電離子，因此流動相組成不僅會影響目標物的保留時間和峰形，還會影響離子化效率及響應值［19］。實驗考察了不同的流動相緩沖體系對硒代蛋氨酸分離效果、峰形及響應強度的影響。對比了4 種不同的流動相緩沖體系，分別為0.2%甲酸+4 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液、0.2%甲酸+6 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液、0.2%甲酸+8 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液、0.2%乙酸+6 mmol/L 乙酸銨+水/乙腈溶液。結果顯示，以0.2%甲酸6 mmol/L 甲酸銨+水/乙腈溶液為流動相時，硒代蛋氨酸的分離效果最佳，峰形尖銳且不拖尾，響應值最高（圖1）；使用其他流動相緩沖體系時存在峰前沿、峰拖尾、峰寬等問題。因此，本實驗選擇0.2%甲酸6 mmol/L甲酸銨水溶液和0.2%甲酸6 mmol/L甲酸銨乙腈溶液作為流動相。

2.2 樣品前處理條件的優化

硒代蛋氨酸在豆類中主要以結合形式存在，本研究采用酶解法進行提取。以富硒黑豆中提取的硒代蛋氨酸的色譜峰面積為指標，考察了胰蛋白酶、蛋白酶K 及兩者共同使用對樣品中硒代蛋氨酸提取效果的影響。胰蛋白酶與蛋白酶K 均歸類于絲氨酸蛋白水解酶，胰蛋白酶作用于堿性氨基酸殘基的羧基側，蛋白酶K 的切割活性較廣，作用于芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸的羧基端［20］。實驗結果顯示，采用兩種酶共同作用于樣品，可斷裂多肽鏈中所有種類的氨基酸，使硒代蛋氨酸更好地游離，得到的色譜峰面積最高，提取效果最優。

2.3 硒代蛋氨酸的斷裂途徑與機理研究

實驗對硒代蛋氨酸進行了碎裂片段機理研究，硒代蛋氨酸的dd-MS2掃描譜圖如圖2A 所示。在ESI正離子模式下，硒代蛋氨酸加氫后形成偶電子離子［21］，分子離子峰為m/z198.002 78［M+H］+，其主要碎裂途徑如圖2B所示。電荷中心位于N原子上的分子離子脫去1分子NH3后形成碎片離子C5H9O2Se+，m/z為180.976 46；或脫去1分子CO，1分子H2O后形成碎片離子C4H10NSe+，m/z為151.997 53。電荷中心位于Se原子上的分子離子經γ-H重排后，脫去1分子C3H7NO2形成碎片離子C2H5Se+，m/z為108.955 60；或由正電荷中心引發i斷裂反應后形成碎片離子C4H8NO2+，m/z為102.055 55。

圖2 硒代蛋氨酸的四極桿靜電場軌道阱質譜圖（A）及碎裂機理示意圖（B）Fig.2 UHPLC/ESI-Q-Orbitrap mass spectrum（A）and fragmentation mechanism（B）of selenomethionine

2.4 基質效應

豆類為復雜基質，富含的蛋白質與脂肪等成分會對硒代蛋氨酸的檢測產生干擾。本實驗通過繪制溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線來判斷基質效應（ME）的強弱。ME=（1-基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率）×100%。ME 絕對值在20%以內為較弱基質效應，在20%～50%為中等強度的基質效應，在50%～100%為強基質效應。通過計算得基質效應為15.75%，表明基質效應較弱，因此本實驗通過基質匹配標準校正法進行定量分析，以減弱基質效應對檢測結果的影響。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

取空白樣品，添加0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 系列水平的硒代蛋氨酸標準溶液，按“1.4”方法進行前處理后上機測定，以目標物的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制基質加標工作曲線，得到本方法的線性范圍、線性方程及相關系數；再分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定檢出限（LOD）及定量下限（LOQ）。結果顯示，硒代蛋氨酸在0.05～0.5 mg/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數（r2）為0.997 6，LOD和LOQ分別為0.015 mg/kg和0.05 mg/kg。

2.6 準確度及精密度

取空白樣品，分別在0.1、0.2、0.4 mg/kg 3 個水平下進行加標回收實驗，按照“1.4”方法處理后上機測定，每個加標水平每日平行測定6 次，連續測定6 d。結果顯示，硒代蛋氨酸在3 個加標水平下的回收率為77.6%～83.2%，日內相對標準偏差（RSDr）為2.8%～4.8%，日間相對標準偏差（RSDR）為4.1%～6.5%（表1），表明本方法的準確度和精密度良好。

表1 綠豆中硒代蛋氨酸的回收率與相對標準偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviations for selenomethionine in mung bean

2.7 實際樣品的測定

采用本方法對產自陜西安康、湖北恩施的富硒豆類進行檢測，得到富硒黑豆、富硒紅豆、富硒綠豆中硒代蛋氨酸的含量分別為0.252、0.163、0.184 mg/kg。圖3為富硒黑豆中硒代蛋氨酸的色譜圖。

圖3 富硒黑豆中硒代蛋氨酸的色譜圖Fig.3 Chromatogram of selenomethionine in selenium-enriched black bean

3 結 論

本研究建立了基于超高效液相色譜-串聯四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜技術的豆類中硒代蛋氨酸的檢測方法，對超高效液相色譜條件和樣品前處理條件進行了優化，并對硒代蛋氨酸的碎裂機理進行了研究。方法學考察及實際樣品檢測結果顯示該方法的基質效應小，準確度和精密度良好，能夠滿足豆類中硒代蛋氨酸的檢測需求，有助于推動富硒產業的高質量發展。