盲肌樣蛋白1（MBNL1）對血小板衍生生長因子誘導大鼠血管平滑肌細胞表型轉換的作用研究

安 潔，信栓力，劉吉祥，常 超，趙秀峰，鄭 杰，連晶晶

（邯鄲市第一醫院心內一科1，神外一科2，河北 邯鄲 056002）

血管壁由外膜、中膜及內膜構成，其中血管平滑肌細胞（VSMCs）占據的比例最高。在正常血管中，VSMCs 主要發揮收縮舒張功能，表現為收縮表型，在細胞發育過程及某些病理狀態下，細胞受到各種生化因子、機械刺激、細胞外基質組分改變等因素的影響，伴隨著α-SMA、SM-MHC 等收縮基因表達下調、細胞過度增殖、細胞遷移、細胞外基質分泌增多等一系列細胞特性改變[1]，VSMCs 發生細胞表型轉換由收縮型向合成型轉化[2]。VSMCs 表型轉換既是對刺激的一種適應性反應，也參與了多種心血管疾病的發病過程，但其具體機制目前尚不完全明確，有待進一步闡明。MBNL1 屬于盲肌樣蛋白家族，是一種重要的RNA 結合蛋白，主要功能是調控多種前體mRNA 的選擇性剪接[3]、調控mRNA 運輸及定位[4]。選擇性剪接是一種轉錄后調控機制，經選擇性剪接可以產生同一基因的不同蛋白異構體，進而發揮不同生物作用。MBNL1 的缺失是強直性肌營養不良的發病機制之一[5，6]，提示MBNL1 對于肌源性細胞的發育分化起著至關重要的作用。既往研究表明MBNL1 可以調控骨骼肌及心肌的分化發育及病理過程的發生[5-8]。然而關于MBNL1 在血管平滑肌中的研究較少。因此，本研究旨在觀察MBNL1 在VSMCs 表型轉換中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 雄性SD 大鼠，體重150～200 g，由華中科技大學實驗動物中心提供，實驗動物飼養于SPF 級動物房，提供12 h 光照，食水充足，所有實驗均符合實驗動物管理規定；DMEM 培養基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA 購于吉諾生物公司；胎牛血清購于Bioind 公司；BCA 試劑盒、PVDF 膜、Alexa Fluor594標記抗小鼠IgG抗體、Lipofectamine 2000 購于賽默飛世爾科技公司；Ⅱ型膠原酶、彈力蛋白酶購于Worthington 公司；大鼠PDGF-bb 購于金斯瑞生物公司；抗-MBNL1 抗體、抗-a-sma 抗體、抗-a-tubulin 抗體、HRP 偶聯抗兔IgG 抗體、HRP 偶聯抗鼠IgG 抗體購于三鷹生物公司；siRNA 購于銳博生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠血管平滑肌原代細胞的分離及培養 選取150～200 g 雄性SD 大鼠，腹腔麻醉處死，酒精消毒后置于無菌實驗臺內，開胸分離胸主動脈，剝離結締組織，用PBS 清洗血污后，放入濃度3 mg/ml 的Ⅱ型膠原酶中，37 ℃酶消10～15 min。剝去血管外膜，將血管剪為2 mm2大小組織塊，加入3 mg/ml 的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化0.5 h。再加入等體積濃度1 mg/ml的彈力蛋白酶,37 ℃消化1.5 h 左右，加入血清終止消化，小心吹散組織塊，離心后即可獲得原代細胞。將細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養基重懸，接種于培養皿，置于37 ℃5%CO2培養基箱中，每2～3 d 換液，細胞匯和度達90%進行傳代。選用第3～8 代細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞鑒定 將大鼠VSMCs 接種于96 孔板，待細胞密度達30%～40%進行免疫熒光實驗對細胞進行鑒定。棄去培養基，用PBS 清洗后加入4%多聚甲醛，室溫下固定細胞15 min，隨后PBS 清洗3 次。加入0.5%Triton-X-100 室溫下通透10 min，用PBST 清洗3次。加入1% BSA 室溫下封閉0.5 h。加入一抗（稀釋濃度為1∶200），4 ℃放置約12 h，PBST 清洗3 次。加入二抗（稀釋濃度為1∶500），室溫下避光放置1～2 h，PBST 清洗3 次。加入DAPI 溶液染核，室溫下避光放置10 min，PBST 清洗3 次，觀察并拍照。

1.2.3 PDGF-bb 刺激實驗及分組 將大鼠VSMCs 接種于培養皿，待細胞匯合度達70%，棄去完全培養基，加入不含血清的DMEM 培養基饑餓24 h，再次更換無血清的培養基，對照組加入PBS，其他各組加入PDGF-bb，終濃度分別為10、20、40、80 ng/ml，48 h 后提取總蛋白。

1.2.4 siRNA 轉染 將大鼠VSMCs 接種于12 孔板，待細胞匯合度達80%～90%，更換為無血清培養基，使用Lipofectamine 2000 按照說明書分別轉染siRNA-nc 及siRNA-mbnl1，siRNA-mbnl1 序 列如下:siRNA -1 GCTGCTGCACAGAAGTTAA,siRNA -2 GGTCGTTGCTCCAGAGAAA,siRNA-2 GCACAATGATTGATACCAA。6 h 后棄去培養液，更換為含10%血清培養基，24 h 后獲取細胞用于遷移實驗，48 h 后提取總蛋白進行檢測。

1.2.5 細胞慢病毒感染 將大鼠VSMCs 接種于12 孔板，待細胞匯合度60%～70%，更換培養基并加入慢病毒，24 h 后換液，48 h 后獲取細胞用于遷移實驗，72 h 后提取總蛋白進行檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡 使用RIPA 裂解液提取蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，取蛋白30 μg，加入5×loadingbuffer 配置為20 μl 體系，99 ℃變性10 min。將SDS-PAGE 凝膠放入電泳液中，加入marker 及蛋白樣本于凝膠孔中，起初以80 V 恒壓電泳，當蛋白到達分離膠，調整電壓至100 V 繼續電泳至底。將凝膠切下轉移至轉膜槽中，加入轉膜液，置于冰水混合物中，以300 mA 恒流將蛋白轉移至PVDF 膜。5%牛奶封閉液室溫下封閉2 h，PBST 洗膜后，加入一抗（按1∶1000 稀釋），4 ℃孵育過夜；PBST 洗膜3 次，加入二抗（按1∶2000 稀釋），室溫下孵育2 h。PBST 洗膜3 次，用ECL 發光液澆膜進行顯影。

1.2.7 Transwell 細胞遷移實驗以基質膠包被基底膜下室側，并制備Lv-nc 組、Lv-mbnl1 組、siRNA-nc 組、siRNA-mbnl1 組細胞懸液。對照組下室中為完全培養基，刺激組下室中為含PDGF-bb 完全培養基，濃度為20 ng/ml。在上室中加入細胞液，每孔含細胞數為5×104個，培養12 h。取出Transwell 小室，用PBS充分浸泡基底膜，并置于結晶紫溶液中染色15 min，用PBS 浸泡3 遍，用棉簽擦掉基底膜上側細胞，進行觀察并拍照。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0 進行統計分析，計數資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠血管平滑肌原代細胞鑒定 對大鼠血管平滑肌原代細胞進行觀察，細胞形態呈現為紡錘狀，并呈典型峰谷樣生長。對α-SMA 進行免疫熒光染色見圖1，經鑒定細胞純度在98%以上。

圖1 大鼠血管平滑肌原代細胞免疫熒光鑒定

2.2 PDGF-bb 刺激大鼠VSMCs 后MBNL1 表達 給予VSMCs 不同濃度的PDGF-bb，α-SMA 蛋白表達下調呈現濃度依賴性，提示細胞模型造模成功；10、20、40、80 ng/ml 濃度刺激下MBNL1 蛋白表達量分別為（1.35±0.09）、（1.67±0.19）、（1.64±0.12）、（1.54±0.33），與對照組比較均增多，差異有統計學意義（P＜0.05），其中以20 ng/ml 最為顯著，見圖2。

圖2 Western blot 檢測不同濃度PDGF-bb 刺激下MBNL1 表達量變化

2.3 MBNL1 敲低及過表達效率檢測 采用慢病毒過表達MBNL1，結果提示Lv-mbnl1 組較Lv-nc 組蛋白表達量顯著增加，見圖3A。分別以siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 轉染細胞，siRNA-2 敲低效果最為明顯，見圖3B，后續實驗選用siRNA-2 進行。

圖3 Western blot 檢測過表達及敲低效率

2.4 MBNL1 抑制大鼠VSMCs 遷移 分別在細胞水平過表達、敲低MBNL1，24 h 后進行Tranwell 遷移實驗，結果顯示Lv-mbnl1 組細胞遷移數為（0.86±0.07），少于Lv-nc 組（1），但差異無統計學意義（P＞0.05），Lv-mbnl1+PDGF-bb 組細胞遷移數為（3.36±0.25），少與Lv-nc+PDGF-bb 組的（4.21±0.27），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4A、4C；siRNAmbnl1 組細胞遷移數為（1.82±0.12），較siRNA-nc組（1）增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；siRNAmbnl1+PDGF-bb 組細胞遷移數為（3.30±0.38），較siRNA-nc+PDGF-bb 組的（2.35±0.14）增多，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4B、4D。

圖4 MBNL1 抑制大鼠VSMCs 遷移

3 討論

我國心血管疾病死亡率高居首位,探究心血管疾病的發病機制是疾病的預防及治療的重要內容。血管平滑肌表型轉換過程中轉錄調節蛋白[9]、細胞周期蛋白[10]、收縮蛋白[11]、離子通道[12]等均存在選擇性剪接調控，通過產生不同的蛋白異構體使細胞表型發生改變。MBNL1 作為一種廣泛存在于各種細胞中的RNA 結合蛋白，近期被證實，參與轉化生長因子（TGF-β）誘導的成纖維細胞分化，這一作用通過影響血清反應因子（SRF）前體mRNA 的選擇性剪接實現[13]。另一項研究表明[8]，MBNL1 參與異丙腎上腺素誘導的心肌肥大過程，其機制為MBNL1 調控Myocardin 選擇性剪接。SRF 是VSMCs 維持收縮表型的至關重要的轉錄因子，通過識別基因中的特定序列，啟動下游標記性基因轉錄。SRF 廣泛存在于多種細胞中，但其調控的收縮基因僅在平滑肌中高表達，這與轉錄共激活因子Myocardin 密切相關[14，15]。MBNL1 可以調控SRF 及Myocardin 選擇性剪接，由此推測MBNL1 可能是血管平滑肌表型轉換過程中發揮作用的重要分子。

本研究表明在細胞水平誘導表型轉換模型，在各個濃度下MBNL1 表達水平上升，說明MBNL1 與VSMCs 表型轉化相關。Woo CC 等[16]研究證實在人VSMCs 中，MBNL1 上調Myh11 等收縮基因表達，進而影響細胞表型轉化。Li Y 等[17]研究表明在脂質、炎癥因子等刺激下，MBNL1 表達下調引起VSMCs 巨噬細胞化，促進動脈粥樣硬化的發生。但是MBNL1對于VSMCs 遷移能力的影響尚無報道。Chen J 等[18]研究證明MBNL1 可以抑制鱗狀上皮癌細胞遷移，推測在平滑肌中可能有相似作用。為了進一步探究其對VSMCs 遷移能力的影響，在細胞水平對MBNL1 進行了過表達和敲低，隨后檢測了細胞的遷移能力。本研究結果發現，過表達MBNL1 可以抑制細胞遷移，但這種抑制作用在正常細胞中并不明顯，僅在PDGF-bb 誘導的細胞表型轉化中作用較為明顯，這提示MBNL1 表達上升是對刺激的一種反饋性保護作用。而敲低MBNL1，不論有無PDGF-bb 作用，均能增強細胞遷移能力，說明MBNL1 對VSMCs收縮表型的維持不可或缺。綜合以上結果，得出MBNL1 抑制VSMCs 發生細胞遷移，進而對血管平滑肌表型轉換起到抑制作用。在PDGF-bb 誘導下MBNL1 表達上調是一種反饋性保護機制。

關于MBNL1 減弱VSMCs 遷移能力的具體機制還尚不明確，有期待進一步探究。伴隨著VSMCs骨架蛋白及細胞外基質的改變，細胞遷移能力隨之改變。骨架蛋白及外基質改變過程涉及到一些關鍵蛋白，如膠原蛋白I（Collagen I）[19]，基質金屬蛋白酶（MMPs）[20]等。MBNL1 可能通過調控這些重要蛋白的選擇性剪接，對VSMCs 遷移能力產生影響，將在下一步實驗中加以驗證。

綜上所述，MBNL1 抑制VSMCs 遷移，進而影響血管平滑肌表型轉換，這可能會成為多種心血管疾病防治的新靶點。