莪術(shù)醇對(duì)肝細(xì)胞癌miR-629、miR-24、miR-130a、miR-17 的影響

黎桂玉，林基勇

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.深圳市中醫(yī)院感染性疾病科，廣東 深圳 518000）

肝癌（liver cancer）是世界上第六大常見癌癥，也是癌癥死亡的常見原因之一[1]，其死亡率在所有癌癥中的排名近年有上升趨勢，2018-2020 年，從第四位躍居第三位[1，2]。肝癌是一種高發(fā)病率惡性腫瘤，在2020 年全球癌癥發(fā)病率統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，肝癌占據(jù)全世界癌癥發(fā)病總數(shù)的4.7%[1]。就發(fā)病率來言，我國屬肝癌大國，據(jù)世界衛(wèi)生組織2020 年最新數(shù)據(jù)顯示，全球肝癌發(fā)病人數(shù)的一半以上出現(xiàn)在中國，其年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為18.2/105，在全球排名第八，而因肝癌死亡的人數(shù)每年達(dá)38.3 萬人左右，這使我國的肝癌死亡率占全世界一半以上。總之，全球尤其是我國的肝癌疾病負(fù)擔(dān)重，嚴(yán)重威脅公眾健康。據(jù)2019 年全國腫瘤登記資料記錄，廣西是肝癌的高發(fā)區(qū)[3，4]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，占病例總數(shù)的75%～85%[1]。肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因素是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、黃曲霉毒素污染的食物、大量飲酒、超重、2 型糖尿病和吸煙等。在中國，肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素是HBV[5]。雖然通過提高衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、篩查血液用品和注射疫苗，HBV 的感染率得到控制，但HBV 的感染率仍然較高。其進(jìn)一步加重肝細(xì)胞癌的疾病負(fù)擔(dān)，給肝細(xì)胞癌的治療增加了難度。肝細(xì)胞癌的防治研究是當(dāng)前學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，雖然進(jìn)展顯赫，但用于治療的有效、無副作用藥物仍然十分稀缺。因此，迫切需要探索治療肝癌的替代方法。廣西道地藥材莪術(shù)，在廣西境內(nèi)分布廣泛，資源豐富，為廣西盛產(chǎn)藥材[6-9]。越來越多的研究顯示，莪術(shù)的有效成分莪術(shù)醇有明顯的抗腫瘤、抑制肝癌、保肝抗炎的作用[10-13]。小分子核糖核酸（microRNAs，miRNAs）在肝癌中異常表達(dá)，調(diào)節(jié)肝癌發(fā)生及發(fā)展[14-17]。有研究顯示，莪術(shù)醇能抑制促癌基因miR-21 的表達(dá)從而發(fā)揮抗肝癌作用[18-21]；莪術(shù)醇可通過調(diào)控microRNAs 的表達(dá)呈現(xiàn)抑制肝癌的作用[22，23]。miR-629、miR-24、miR-130a 和miR-17 在肝癌發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，miR-629、miR-24 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)明顯升高[24]，miR-130a[25]和miR-17-3P 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下降。但莪術(shù)醇對(duì)肝癌miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P 和miR-17-3P 表達(dá)的調(diào)控作用尚不明確。為此，本研究重點(diǎn)探討莪術(shù)醇對(duì)肝癌miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P 和miR-17-3P 表達(dá)的影響，從microRNAs 角度揭示莪術(shù)醇抗肝癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2 購于江陰齊氏生物科技有限公司，莪術(shù)醇購于北京索萊寶科技有限公司（IC0620），miRcute miRNA isolation kit 購于天根生物科技有限公司（Cat# DP501），氯仿購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司，無水乙醇購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司，DEPC 水購于北京索萊寶科技有限公司，miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 購于天根生物科技有限公司（Cat#KR201），miRcute miRNA Detection Kit（SYBR Green）購于天根生物科技有限公司（Cat# FP401），DMSO 購于Amresco（Cat#D8370）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取人肝癌細(xì)胞株HepG2，于DNEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、10 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素）中，置室溫37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測莪術(shù)醇對(duì)miR-17、miR-130 和miR-24、miR-629 表達(dá)的影響 將培養(yǎng)的HepG2 接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，3 瓶/組，密度為4×104個(gè)/ml，待細(xì)胞生長良好，將其分為對(duì)照組、不同濃度莪術(shù)醇藥物組。莪術(shù)醇（50、100 μg/ml，少量DMSO 溶解）藥物組換入含莪術(shù)醇的培養(yǎng)液干預(yù)，對(duì)照組予少量DMSO，作用48 h 后，提取各組總RNA：加入Trizol試劑，加入氯仿，離心分離，加入異丙醇，離心，乙醇洗滌沉淀，離心，分離白色RNA 沉淀，分光光度計(jì)檢測RNA 純度、濃度，特異性逆轉(zhuǎn)目的miRNA，合成相應(yīng)cDNA，熒光定量PCR 儀檢測分析。miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P、miR-17-3P 和U6引物序列如下：miR629 -3P：foward 5'TTCTCCCAACGTAAGCCCAGC 3'；miR24 -1 -3P：forward 5'TGGCTCAGTTCAGCAGGAACA 3'；miR130a -5P：forward 5'GCTCTTTTCACATTGTGCTACT 3'；miR17-3P：foward 5'CTGCAGTGAAGGCACTTGTAG 3'；U6（內(nèi)參）：foward 5'CTCGCTTCGGCAGCACA 3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphpadPrism 5.0 版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用（）表示，組間比較行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

兩個(gè)莪術(shù)醇藥物組中miR-130a-5P、miR-17-3P 的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩個(gè)莪術(shù)醇藥物組中miR-629-3P、miR-24-1-3P 表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；50 μg/ml 莪術(shù)醇藥物組的miR-17-3P表達(dá)水平高于100 μg/ml 莪術(shù)醇藥物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩個(gè)莪術(shù)醇藥物組其余miRNAs 表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 莪術(shù)醇調(diào)控肝細(xì)胞癌miRNAs 的表達(dá)

3 討論

目前，肝細(xì)胞癌的5 年生存率依舊較低[26]，其發(fā)病率和死亡率仍較高[1]。索拉菲尼是近年研制的抗肝癌新藥，雖對(duì)肝癌有一定療效，但昂貴的費(fèi)用和嚴(yán)重不良反應(yīng)使其應(yīng)用受到限制。因此，關(guān)于肝細(xì)胞癌的保守替代療法還需要探索。不斷深入探索肝細(xì)胞癌的保守替代療法，尋找不良反應(yīng)少甚至無毒副作用的藥物，提高肝細(xì)胞癌患者的生存質(zhì)量，成為肝細(xì)胞癌治療研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

目前認(rèn)為，眾多基因和環(huán)境因子參與肝癌的發(fā)病。近年來，肝細(xì)胞癌的治療已經(jīng)建立在miRNAs 的基礎(chǔ)上。miRNA 最初于2001 年被研究者從線蟲、果蠅及人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。miRNA 是一種小型非編碼RNA分子，通過綁定目標(biāo)mRNA 的3’未翻譯區(qū)（3′-untranslated regions，3′-UTRs）調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。人類基因組編碼1000 多個(gè)miRNAs，超過50%的細(xì)胞mRNA 受miRNA 調(diào)控。miRNA 對(duì)細(xì)胞有諸多作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等有重要調(diào)控作用。越來越多的研究報(bào)道[27]，miRNAs 通過調(diào)控基因表達(dá)，使其在諸多癌癥如肺癌、結(jié)腸癌、骨癌、乳腺癌和肝癌等進(jìn)展中占據(jù)關(guān)鍵地位，而miRNAs 在肝臟疾病和肝癌組織中異常表達(dá)。這些研究將為用于肝癌早期診斷生物標(biāo)記物的開發(fā)提供可能[28，29]。有研究報(bào)道[30]，miRNA 通過改變免疫微循環(huán)，反轉(zhuǎn)免疫耐受，壯大抑制腫瘤的免疫性應(yīng)答。以往研究證實(shí)[31-34]，多種miRAN 在肝癌組織或細(xì)胞中反常表達(dá)，這些miRANs 是調(diào)控肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一，將逐步成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。

在中醫(yī)古籍上，肝癌并無對(duì)應(yīng)病名，但相似癥狀、體征卻早有記載。《素問·腹中論》曰：“有病心腹?jié)M，旦食不能暮食，此為何病？對(duì)曰：名鼓脹”。《圣濟(jì)總錄》：“積氣在腹中，久不瘥，牢固推之不移者，癥也……按之其狀如杯盤牢結(jié)，久不已，令人身瘦而腹大，致死不消。”肝癌當(dāng)屬中醫(yī)癥瘕、積聚、黃疸等病癥范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，莪術(shù)具有祛瘀破血，行氣止痛的功效。《日華子本草》言：“治一切氣滯……消瘀血，止撲損痛，下血及內(nèi)損惡血等。”以往研究報(bào)道莪術(shù)具有抗腫瘤[35-37]、抗肝癌[38-40]的作用。莪術(shù)的破血消積，行氣止痛功用，對(duì)應(yīng)主治癥瘕、積聚、心腹?jié)M痛等病癥。無論是從現(xiàn)代藥理研究還是從民族醫(yī)藥文獻(xiàn)資料記載來看，莪術(shù)都具有明顯的保肝抗炎、抑制肝癌的作用。莪術(shù)含有豐富的揮發(fā)油，該揮發(fā)油中具有多種活性成分，莪術(shù)醇是其主要活性成分之一，屬倍半萜烯類物質(zhì)。莪術(shù)醇作為中藥莪術(shù)的主要有效成分，歷年《中國藥典》均將莪術(shù)醇的含量列為莪術(shù)質(zhì)量監(jiān)控的標(biāo)準(zhǔn)。越來越多的研究報(bào)道，莪術(shù)醇具有顯著抑制肝癌作用，通過抑制細(xì)胞周期蛋白基因的表達(dá)，阻斷肝癌細(xì)胞周期G1期發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡及抑制其增殖的作用[23,41-44]。

研究顯示，miR-629、miR-24 在肝細(xì)胞癌中表達(dá)明顯升高[24]，miR-130a[25]在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下降，miR-17-3P 與肝癌發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-629、miR-24 在肝癌HepG2 細(xì)胞中在治療前為高表達(dá)，與以往研究報(bào)道一致[24]，莪術(shù)醇作用后其表達(dá)下調(diào)。miR-130a 及miR-17-3P 在腫瘤中的作用尚存在爭議。有研究顯示，miR-130a 在肝癌組織中低表達(dá)[25]，也有研究顯示其可在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞高[46]。同時(shí)，有研究顯示，miR-17-3P 有抑制腫瘤作用[47]，亦有研究顯示其促進(jìn)腫瘤發(fā)展[45]。本研究結(jié)果顯示，miR-130a、miR-17-3P在肝癌HepG2 細(xì)胞中在治療前為低表達(dá)，莪術(shù)醇作用后能上調(diào)miR-130a、miR-17-3P 的表達(dá)。

綜上所述，莪術(shù)醇可能通過上調(diào)miR-130a、miR-17-3P 的表達(dá)，下調(diào)miR-629、miR-24 的表達(dá)，發(fā)揮抗肝癌的作用。