基于轉錄組測序技術對調控畢加索小丑魚（Picasso clownfish）白化體征關鍵基因的研究

何麗斌 ，黃鎮, ，吳水清，鄭樂云

(1.福建省水產研究所，福建 廈門 361013；2.福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350117；3.福建省特色海洋生物資源可持續利用重點實驗室，福建 福州 350117)

1 引言

海洋觀賞魚類的體色多彩多樣，是脊椎動物最豐富的形態特征之一，對于動物生存、進化具有重要的意義。體色及其形狀、紋路等不同色素模式是魚類最直觀的適應性狀之一，影響著魚類的聚集、躲避敵害、警告獵食者或競爭者及性選擇，且對魚類的識別具有重要的意義[1-2]。

小丑魚屬于雀鯛科（Pomacentridae），?？~亞科（Amphiprioninae）[3]。小丑魚在世界范圍內共有20 多種，是重要的海洋觀賞魚類[4]。其中，畢加索小丑魚是黑背心小丑魚（Amphiprion percula）自交產生的后代中出現的品種[5]，由于其皮膚組織具有不規則的白色、黃色和黑色斑塊與紋路，因而具有較高的觀賞性與商品價值。由于黑色或者黃色個體的皮膚組織發生白化現象，最后導致其出現不規則的白色斑塊皮膚。白化的特征表現為皮膚、頭發和眼睛中缺乏黑色素，是自然界中常見的體色變異[6]。已有研究表明[7]，白化的表型在不同種類的動物中受到不同的基因表達調控，因此，白化表型產生的分子機制因物種而異。已有的研究表明[8]，白化現象與溶酶體途徑在遺傳上有關，并與人類疾病相關。在漁業生產中，體色也是一個重要的價值特征，例如白化海參的市場價值明顯高于正常顏色的海參（黑褐色、灰褐色或者黃褐色）[9]。因此，闡明白化產生的分子機制不僅有益于人體健康，而且為體色育種提供重要線索。

2 材料與方法

2.1 材料采集

實驗用畢加索小丑魚取自福建省水產研究所生態實驗室，為同一親本產生的后代。根據《ARRIVE 2.0 指南》和美國國立衛生研究院《實驗動物護理和使用指南》（NIH 出版物編號8023，1978 年修訂）進行動物樣品采集工作和實驗方案制定。排除性別差異和體型相似（體長為（35.2±1.5）mm），實驗隨機挑選了9 尾的亞成魚個體，包括3 尾白化魚、3 尾黃色魚（以下簡稱黃魚）和3 尾黑色魚（以下簡稱黑魚）（圖1a），3 種魚在胸鰭與臀鰭身體兩側之間相同部位分別呈現白色、黃色、黑色的皮膚組織。在本研究中，將白化樣本編號為A_1、A_2 和A_3，黃色樣本編號為Y_1、Y_2 和Y_3，黑色樣本編號為B_1、B_2 和B_3。實驗剝取了魚的皮膚組織后將組織切成小塊并在磷酸鹽緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS）中洗滌3 次。實驗將每份樣品的皮膚組織均分為兩份，將一份儲存在液氮中備用，另一份用于提取總RNA。

圖1 3 種小丑魚皮膚組織的表型差異以及基因表達差異Fig.1 Phenotypic differences and gene expression differences in skin tissues from three species of Picasso clownfish

2.2 轉錄組測序

使用TRIzol 試劑（Invitrogen，加拿大）從皮膚組織中提取總RNA 后通過Agilent 2 100 方法檢測 RNA 樣品純度、濃度和完整性。質量控制后，使用oligo（dT）磁珠從每個樣品的 1 μg 總RNA 中分離帶poly（A）的mRNA，隨后采用超聲處理成隨機片段。使用TruSeq RNA 文庫制備試劑盒v2（Illumina，美國）構建cDNA文庫，基于Illumina HiSeqTM2500 高通量平臺，以Pair-end 150 bp 雙端測序模式對cDNA 文庫進行轉錄組測序。

2.3 序列比對

為了獲得高質量的數據，使用SolexaQA 軟件從原始讀數數據中修剪接頭和低質量讀數[10]。以眼斑雙鋸魚(Amphiprion ocellaris)（GenBank:NXFZ00000000.1）為參考基因組，利用HISAT2 軟件，將過濾后的轉錄組數據使用默認參數與參考基因組進行比對。通過Burrows Wheeler（BWA）軟件將過濾后的基因組測序數據與參考基因組進行比對[11-12]。

2.4 差異表達基因分析

使用 Hisat2-build v 21.0[13]軟件構建參考基因組的索引，使用HISAT v 2.1.0[13]將轉錄組數據比對至參考基因組。基于基因長度計算每個基因的表達量（FPKM），并使用StringTie[14]v1.3.5 軟件計算基因的讀數計數。本研究中的差異表達基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）分析采用BH 法校正的p值（p＜0.05）為標準閾值。

2.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

以p＜0.05 為閾值，分別使用GOseq R Bioconductor 包和KOBAS 2.0 對差異基因進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析[14-15]。

2.6 qPCR 驗證

通過Primer Premier 5.0 軟件設計靶基因（adcy5、akdp7、crabp1、creb3l2、ednrb、flt4、fzd2、gng10、ivns1abp、nkiras1、robo4、ssbp2、tfpi2、wnt11、zdhhc2）的引物（表S1），所設計的引物均在不同的外顯子上，在qPCR 檢測中能避免基因組DNA 污染。使用Promega公司的GoScript? Reverse Transcriptase System試劑盒將總RNA 逆轉錄合成cDNA。使用Maxima SYBR Green qPCR Mix（2X）進行qRT-PCR，總反應體積為20 μL，包括10 μL SYBR qPCR Mix、0.8 μL 正向引物、0.8 μL 反向引物、2 μL cDNA 和6.4 μL 無RNase 的水。PCR 擴增程序：95°C 30 s、95°C 5 s、59°C 10 s、72°C 15 s 共40 個循環。通過Bio-Rad 公司的iQ5 軟件檢測熒光信號并計算熔解溫度。以β-actin 為對照，采用2-ΔΔCt法分析各靶基因的相對表達量[16]。本實驗對轉錄組測序樣本的所有3 個生物學重復均使用3 個技術重復進行基因表達量驗證。

3 結果

3.1 轉錄組測序

通過樣品取樣、RNA 提取、文庫構建和上機測序，本實驗9 份樣品獲得的原始讀數數量在450×104～650×104之間，數據質控后93%～98%的讀數為可用讀數。每個樣品與參考基因組的比對率均大于75%。通過FPKM 值估計皮膚組織中基因的表達水平，結果顯示，所有樣品中基因表達的分布相似，表明沒有系統性的基因表達差異。樣本間的相關系數結果顯示，所有樣本都表現出良好的相關性，且同一組的樣本表現出更強的相關性水平，表明每組都有良好的生物學重復。

3.2 差異表達基因的鑒定

本實驗通過進一步比較3 組樣品之間的轉錄組表達量來分析DEGs。結果顯示，與黃色皮膚樣品相比，白色皮膚樣品中有1 312 個DEGs，其中包括359 個上調基因和953 個下調基因（表S2）。與黑色皮膚樣本相比，白色皮膚樣本中總共有1 578 個DEGs，包括331 個上調基因和1 247 個下調基因（表S3）。此外，黑色皮膚與黃皮膚樣本相比存在65 個DEGs，其中9 個下調基因，56 個上調基因（表S4，圖1b）?；诮M間的DEGs，利用基因的表達值對樣本進行聚類，結果顯示，所有樣品表現出與膚色一致的聚類模式（圖2）。本實驗發現基于DEGs 比基于全基因組表達數據有更好的聚類結果，表明DEGs 能夠反映組間的核心差異。

圖2 基于差異表達基因對3 種樣本和基因進行層次聚類Fig.2 Hierarchical clustering of 3 samples and genes using differentially expressed genes

3.3 差異表達基因在與黑色素生成相關的生物過程中的功能作用

為了進一步解析畢加索小丑魚白色皮膚中特異性DEGs 的功能，我們對白色和黃色相比（標記為Avs-Y）的DEGs、白色和黑色相比（標記為A-vs-B）的DEGs 分別進行了GO 功能富集和分析（圖3）。結果顯示，A-vs-Y 和A-vs-B 的差異基因集均在蛋白質結合（如細胞黏附和趨化因子受體結合）、蛋白質轉運（如核轉運）、蛋白質入細胞核和調控信號（如生長調節和酶調節活性）這些GO 生物學過程中存在顯著的富集水平（表S5，表S6）。我們也對這些差異基因進行了KEGG 通路富集，結果顯示，存在7 條富集顯著的信號通路（p＜0.05），包括細胞外基質-受體互作黏著斑、細胞黏附分子、緊密連接、細胞因子-細胞因子受體相互作用、鈣信號通路和酪氨酸代謝（表S7）。同時，我們還發現許多DEGs 參與Wnt 信號通路、Hedgehog 信號通路、苯丙氨酸代謝和黑色素合成通路。雖然這些通路在KEGG 富集分析中不顯著，但它們與色素細胞分化和皮膚顏色密切相關。

圖3 基于白色-黃色（A-vs-Y）和白色-黑色（A-vs-B）皮膚組織的組間差異表達基因生物學功能富集Fig.3 Biological function enrichment of intergroup differentially expressed genes based on white-yellow (A-vs-Y) and white-black (A-vs-B) skin tissues

我們將黑色與白色皮膚的轉錄組數據進行相比，發現在白色皮膚樣品中涉及黑色素生成的基因存在下調趨勢（例如ednrb、ednra、tyr、mitfa和dct）。結果顯示，雖然多數基因表達水平沒有出現顯著下調，但參與黑色素合成的25 個基因在白化皮膚中的表達水平出現了明顯的降低（圖4）。此外，我們還發現了在Hedgehog 信號通路和Wnt 信號通路中的DEGs（包括wnt9b、wnt5b、wnt11和wnt3a），顯示出從黑色到黃色到白化樣本其表達水平逐漸降低的現象。以上結果表明，這些基因在黃色和白化皮膚組織中的抑制表達可能會阻斷信號傳導過程和下游生物合成途徑（包括黑色素生物合成）。因此，通過多個信號通路的基因表達水平研究表明，畢加索小丑魚的白色皮膚的產生可能是由多個信號通路上的異?；虮磉_共同引起的。

3.4 使用實時熒光定量PCR 進行差異表達基因驗證

為了驗證以上分析結果，我們使用黑色素生物合成通路中5個核心的DEGs（adcy5、creb3l2、ednrb、fzd2、wnt11）以及在A-vs-Y 和A-vs-B 比較之間隨機選擇了10 個DEGs（akap7、crabp1、flt4、gng10、ivns1abp、nkiras1、robo4、ssbp2、tfpi2、zdhhc2）設計引物，通過熒光定量PCR 相對定量法檢測這些基因的表達情況，并與轉錄組分析結果進行比較。得到的基因表達量的結果與轉錄組測序所得結果趨勢一致（圖5）。5 個DEGs 的表達水平（例如ednrb）均顯示出一致的變化趨勢（圖5），證實了轉錄組分析結果的可靠性。

圖5 參與黑色素生成的關鍵功能基因的驗證Fig.5 Validation of key functional genes involved in melanin production

4 討論

畢加索小丑魚為黑背心公子小丑魚（Amphiprion percula）的遺傳變異體[5]，以其不規則的條紋圖案和體色深受廣大消費者的喜愛，而在養殖過程中產生的白色皮膚花紋雜亂無章的畢加索小丑魚極為珍貴，但其皮膚產生白色皮膚的遺傳機制目前仍然未知[5]。已有研究結果表明[17-18]，關鍵基因的異常表達（例如tyr）與白化現象密切相關。在本研究中，我們對畢加索小丑魚的同一部位，但是不同顏色的皮膚組織進行了轉錄組測序，確定了小丑魚不同顏色皮膚組織的DEGs，并分析了白色皮膚組織中DEGs 的生物學功能。

在3 種皮膚組織兩兩比對的差異基因數目中，白色與黑色相比的差異基因數目最多，白色與黃色相比的次之，而黑色與黃色相比的差異基因數目最少，提示在皮膚組織從黑色到黃色再到白色中，存在許多基因的表達受到逐層抑制現象。我們對白色與黑色、白色與黃色相比得到的DEGs 進行了KEGG 通路的功能富集分析，結果表明，這些DEGs 參與了細胞外基質受體相互作用、黑色素生成、Hedgehog 信號通路和 Wnt 信號通路的調控。許多參與細胞外基質受體相互作用的膜受體的基因（如lama2/3/4、thbs1b/2a/3a/4a、vtna和argn）在白色皮膚組織中表達水平出現顯著下調（表1）。有研究結果表明，許多細胞外基質受體相互作用基因可能影響早期色素細胞增殖或分化，進而影響黑色素細胞對膚色的調控[19]。Wnt 信號通路也與黑色素合成有關，已有研究表明[20]，抑制Wnt/β-catenin 信號通路會抑制黑色素生成。有研究報道[21]稱，wnt1在調節黑色素細胞的分化方面發揮重要作用，并且wnt1基因在Wnt 信號通路和Hedgehog 信號通路中都起調控作用，本研究發現，畢加索小丑魚白色皮膚的wnt1基因表達量明顯低于黑色皮膚，表明wnt1基因在調控小丑魚皮膚中的黑色素生成方面發揮重要作用。

表1 參與 ECM 受體相互作用的基因表達量Table 1 Expressions for genes involved in the ECM-receptor interactions

我們還分析了其他色素細胞中涉及基因的表達水平（包括黃素、紅素、虹色素、白細胞和氰基），發現這些基因在黃色和黑色樣本之間存在顯著的表達差異（表2）。而已有研究顯示[22]，Sox5作為Pax7a的下游基因發揮作用，控制葉黃素的分化和發育。本實驗發現，參與葉黃素分化的Sox5基因（表S2，表S3）在白色-黃色和白色-黑色比較中均表現出顯著的基因表達差異，這可解釋黃色和白化皮膚之間的顏色差異。

表2 參與色素沉積過程的基因表達量Table 2 Expressions for genes involved in the pigmentation process

續表 2

有研究顯示[6,10]，黑色素合成中的核心功能基因出現基因突變是導致許多物種白化現象的重要原因。研究結果顯示，多數基因在黑色和白化樣本之間表現出差異表達，并且表現出從黑色到黃色再到白化樣本逐層遞減表達的現象，并觀察到參與黑色素合成的3 個核心基因（tyr、tyrp1b和dct）在白色皮膚樣本中均出現基因表達量急劇下降現象。我們還發現，大多數差異表達的基因均表現出從黑色到黃色再到白化樣品逐漸降低的表達，與許多參與黑色素生成的重要基因顯示出一致的表達模式。如圖4 所示，我們發現有11 個基因（ednrba、calm1b、adcy5/9、kitlga、kitb、wnt、fzd2/9a、mitfa、tyr、tyrp1b和dct基因）的表達水平在黑色樣品中最高，但卻在黃色和白化樣本出現下調。其中，tyr基因負責編碼酪氨酸酶，該酶有研究報道是黑色素合成的限速酶[23]；tyrp1基因是一種酪氨酸酶相關蛋白，特異性位于黑色素細胞中，參與黑色素合成[24]；而kitlga基因是編碼KIT 的配體[25]，在調節酪氨酸酶基因家族的轉錄和黑色素合成中發揮作用[26-27]；MITF基因的突變與人類的白化病有關[28]，并且有研究表明，MITF基因表達量差異會影響黑色素合成和黑色素細胞存活[29]。綜上所述，我們解析了畢加索小丑魚不同顏色皮膚組織的轉錄水平差異基因，發現了一批與黑色素生成密切相關的基因在白色皮膚組織中表達量明顯下調的現象，為研究小丑魚白色皮膚發生機理提供了理論基礎，并為今后人為干擾基因表達從而達到調控小丑魚體色提供理論依據。

圖4 參與黑色素生成的關鍵功能基因的表達Fig.4 Gene expression for key functional genes involved in the melanogenesis

補充材料

表S1 驗證黑色素生成關鍵功能基因表達的熒光定量PCR 引物

表S2 白化與黃色皮膚之間的差異基因

表S3 白化與黑色皮膚之間的差異基因

表S4 黃色與黑色皮膚之間的差異基因

表S5 白色與黑色皮膚之間的差異基因的功能富集分析結果

表S6 白色與黃色皮膚之間的差異基因的功能富集分析結果

表S7 不同皮膚之間的差異基因的信號通路富集分析結果

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