瘤背石磺體腔細胞分類、免疫相關酶特性及初步轉錄組學分析

呂庭莉 ，杲紹強，張虎，張易嬋，陳鵬 ，王嘉偉，喬幗，楊伯平，張明明*

(1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023；2.鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051；3.邳州市新河鎮農業技術推廣服務中心，江蘇 徐州 221313；4.江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007；5.鹽城工學院 電氣工程學院，江蘇 鹽城 224051)

1 引言

瘤背石磺（Onchidium struma）隸屬軟體動物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、石磺科（Onchidiidae），俗稱土海參，又名海賴子，具有豐富的營養價值和藥用價值[1]。主要生長在潮間帶灘涂中，其背部表皮角質層厚，溫度適應性強，適應陸棲生活[2]，因有自由生活幼蟲期而被認為是海洋生物向陸地生物輻射進化的重要代表物種[3]。此外，瘤背石磺屬于海洋灘涂底棲動物，其早期發育對各種環境因子的變化尤為敏感，且因其幼蟲易于采集和培育，常被用于評價海洋污染物的毒性，也可被作為海洋生態環境監測的指示生物[4]。

近年來，瘤背石磺作為一種具有較高經濟和營養價值的海產珍品，日益受到人們的青睞，但由于環境污染、濫采濫捕或過度采捕等因素，其自然資源量已急劇減少。人們已經對瘤背石磺的人工養殖進行了研究[5]，但是尚未突破其規模化養殖技術。因此，研究瘤背石磺基礎免疫學將對其生長、發育、繁殖和物種保護具有重要意義。

目前人們普遍認為，包括軟體動物在內的無脊椎動物缺乏適應性免疫，完全依賴于先天性免疫應答[6]。牡蠣和貽貝等雙殼類通過血細胞吞噬侵入的微生物、促進傷口愈合、消化食物和運輸營養[7-8]；體腔液及其體腔細胞是海參先天性免疫防御的重要組成部分，發揮著重要的免疫防御作用，具有氧化殺滅、吞噬清除、凝集和創傷修復等多種防御功能[9-10]。近年來，隨著科學技術的不斷發展，國內外學者相繼利用單克隆抗體、熒光標記及分子生物學技術對海參（Holothurioidea）、海膽（Echinoidea）和海星（Asteroidea）等棘皮動物體腔細胞的形態、功能和發生進行了深入研究，進一步揭示了棘皮動物體腔細胞在免疫系統中的重要作用[11-13]。但人們對瘤背石磺體腔細胞的特點及其在免疫防御中的作用知之甚少。

轉錄組學是一門基于整體轉錄水平來研究基因轉錄圖譜并揭示生物學通路和性狀調控網絡分子機制的學科，近年來被廣泛應用于生物學研究中[14-15]。高通量RNA-Seq 測序技術是目前廣泛應用的第二代檢測技術，具有高通量、高準確性、成本低等優點[16]，基于此技術，不僅轉錄組本身及其調控復雜性的認知被大大拓展，有關生物體的功能基因組學研究也被深入推進[17]，如刺參（Apostichopus japonicus）[18]和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）等[19]。藉此，本研究利用RNA-Seq 測序技術對來自健康瘤背石磺的體腔細胞進行轉錄組學分析，豐富其遺傳信息；此外，本文研究了瘤背石磺體腔細胞的免疫相關酶和抗氧化酶活性，統計了體腔細胞中各主要類型體腔細胞的密度，研究結果將為今后進一步研究瘤背石磺的基礎免疫學提供寶貴的基礎數據，對于提高人工繁育的效率和質量、遺傳圖譜的建立和物種保護提供有價值的參考。

2 實驗材料與方法

2.1 材料

健康瘤背石磺（平均體質量：（8.3±0.5）g）采自江蘇省射陽縣新洋港潮間帶，帶泥運回實驗室后，在塑料飼養箱內（70 cm × 50 cm × 40 cm，90 頭/箱）暫養3 d。塑料桶內鋪上8～12 cm 厚的海泥，再鋪上半圓形瓦片供瘤背石磺隱藏和附著。每個飼養箱用網紗覆蓋，用于通風、觀察和防止瘤背石磺逃生。飼養箱內的相對濕度通過噴灑人工海水保持在80%左右，與自然生活潮間帶濕度相近[20]，室溫保持在（26±1）℃。暫養期間，投喂螺旋藻（粗蛋白57.64%、粗脂肪2.73%、灰分7.53%、鈣0.2%、磷0.79%和水分8.28%），日投喂量為體質量的2%，將螺旋藻涂抹于無菌玻璃上，并在飼喂2 h 后清理干凈，防止藻類腐敗發臭以保持良好的養殖環境。

2.2 實驗方法

2.2.1 瘤背石磺體腔液的采集

暫養3 d 后，將瘤背石磺隨機分到3 個飼養箱中，每箱放置15 頭。從每箱中隨機選取3 頭瘤背石磺，用無菌海水沖洗體表海泥后，解剖紙吸干水分，用無菌手術剪沿瘤背石磺腹部縱向解剖，并用50 mL 離心管收集體腔液。記錄體腔液體積后，取100 μL 體腔液與等體積的抗凝劑（葡萄糖：20.8 g/L、檸檬酸鈉：8 g/L、EDTA ：3.36 g/L、氯化鈉：22.5 g/L，pH：7.5）混勻，進行體腔細胞計數。剩余體腔液于4℃、3 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和底層細胞沉淀，每3 頭瘤背石磺的上清液混合作為一個平行樣本，-80℃保存，用于免疫相關酶和抗氧化酶活性測定；底層細胞加入RNA 保護劑以防止RNA 降解，立即放于液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存備用，用于轉錄組學分析。

2.2.2 瘤背石磺體腔細胞的分類和數量分析

將處理獲得的體腔液制作細胞涂片，在40 倍光學顯微鏡（Olympus,PH100-3B41L-IPL）下觀察體腔細胞并依據形態、大小和核質比進行細胞分類。

將體腔液滴于血球計數板（25×16）上，并在光學顯微鏡下測定總體腔細胞密度（Total Coelomocytes Density,TCD）和不同類型體腔細胞密度（Different Coelomocytes Density,DCD）。計算公式為

式中，A為25 中方格內總體腔細胞數之和（單位：cells/mL）；B為稀釋倍數；C為25 中方格中某類型體腔細胞數之和（單位：cells/mL）。細胞計數重復3 次。

2.2.3 瘤背石磺體腔液中免疫相關指標活性測定

通過試劑盒測定體腔液中酸性磷酸酶（Acid Phosphatase,ACP）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AKP）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）活力及總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity,T-AOC），試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，根據說明書進行操作和活力計算。

2.2.4 瘤背石磺體腔細胞轉錄組學分析

2.2.4.1 總RNA 提取和cDNA 文庫的構建

cDNA 文庫的構建及測序在北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行。根據使用說明書從體腔細胞中提取總RNA，RNA 的質量經Agilent 2100 生物分析儀檢測合格后用于cDNA 文庫構建。根據RNA 質量篩選獲得6 個樣品的RNA，純化后，使用fragment buffer 將包含Poly(A)的mRNA 片段分成200～250 bp 的短片段。使用N6 引物將片段化的RNA 轉錄入第一鏈cDNA，隨后合成第二鏈cDNA。用QIA quick PCR 試劑盒純化雙鏈cDNA，之后通過2%瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段。使用PCR primer cocktail 和PCR master mix 進行PCR 擴增來富集合適的銜接子連接的片段。PCR 產物經ampureXP 珠純化后使用Illumina HiSeq? 3000 平臺進行測序。

2.2.4.2 Unigenes 功能注釋與分類

獲得原始片段后，使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk//projects/fastqc/）軟件進行質量分析，去除帶有接頭、低質量和N（表示無法確定堿基信息）比例大于10%的序列，獲得過濾后數據。將過濾后的數據用Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）組裝出全長轉錄本序列。在已知的核苷酸和蛋白質數據庫中，將所有組裝的Unigenes 通過BLASTX進行比對，去掉E-value 值大于10-5的比對序列。數據庫包括：NCBI 核酸數據庫（Nt:https://www.ncbi.nlm.nih.gov）、NCBI 冗余蛋白質數據庫（Nr:http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、PFAM（HMMER3.0package）、Swiss-Prot 數據庫（http://www.uniprot.org）、COG 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）和KEGG 數據庫（http://www.genome.jp/kegg）。

2.3 數據處理

3 結果

3.1 瘤背石磺體腔細胞的分類和數量

根據細胞形態、大小、核質比、顏色和相關研究報道[21]，將瘤背石磺的體腔細胞分為變形細胞（圖1a）、球形細胞（圖1b）和色素細胞（圖1c）。變形細胞類似海參中的變形細胞，細胞形狀各異，大小不一，細胞核呈圓形，胞質中含有大量的絲狀偽足，呈花瓣狀[22]；球形細胞靜止時呈球形，內部均勻充滿了小球狀顆粒，大小不一；色素細胞的形狀各異，大小不一，呈黃色或棕色。在瘤背石磺體腔液中，3 類細胞的密度由多到少依次為球形細胞（（6.17±0.14）×106cells/mL）、變形細胞（（1.40±0.30）×105cells/mL）、色素細胞（（7.00±0.40）×104cells/mL）（圖2）。

圖1 瘤背石磺體腔液中不同類型體腔細胞的顯微形態（×40）Fig.1 The micro-morphology of different coelomocytes in coelomic fluid of Onchidium struma (×40)

圖2 瘤背石磺體腔液中不同類型體腔細胞的密度Fig.2 Density of different coelomocytes in coelomic fluid of Onchidium struma

3.2 瘤背石磺體腔液免疫相關酶活性分析

無外源刺激下瘤背石磺體腔液中ACP、AKP、TAOC、SOD 和PO 均有活力，ACP、AKP、T-AOC、SOD 和PO 活性分別為（0.98±0.60）U/mL、（4.68±0.98）U/mL、（0.01±0）U/mL、（21.59±1.33）U/mL 和（180.34±2.85）U/mL，其中，PO 活性最高。

3.3 瘤背石磺體腔細胞高通量測序與序列拼接

瘤背石磺體腔細胞6 個文庫的序列統計見表1。原始序列過濾后，共獲得328 759 318 條原始測序數據和318 727 812 條過濾后數據，過濾后數據比例為96%。在這些過濾后數據中，Q20 值為97.51%，Q30 值為92.91%，GC 含量為40.66%，這表明測序質量較好，可用于后續分析。

表1 瘤背石磺體腔細胞6 個文庫的序列統計Table 1 Statistics of transcriptomic sequences from six libraries formed from coelomocytes of Onchidium struma

將來自6 個文庫的過濾后數據使用Trinity 軟件進一步組裝得到63 097 個Unigenes，其平均長度、最長長度和最短長度分別為1 520 bp、29 277 bp 和301 bp。此外，過濾后數據被組裝成124 853 個轉錄本，它們的平均長度、最長長度和最短長度分別為1 974 bp、29 277 bp和301 bp（圖3）。瘤背石磺體腔細胞轉錄本測序原始數據在NCBI 中的登錄號分別為：SRR6118632、SRR6118633、SRR6118634、SRR6118635、SRR6118636和SRR6118637。

圖3 瘤背石磺體腔細胞Unigenes 和Transcript 長度分布Fig.3 Length distribution of all Unigenes and Transcript from coelomocytes in Onchidium struma

3.4 Unigenes 功能注釋與分類

63 097 個Unigenes 在GO、KO、KOG、NR、NT、PFAM 和SwissProt 數據庫中成功注釋的比例分別為33.33%、11.5%、11.55%、30.64%、9.45%、33.33%和20.85%。

在這些Unigenes 中，99%以上的Unigenes 與NCBI數據庫中的注釋序列的相似性大于40%（圖4a），18.4%的Unigenes 的E值大于10-15（圖4b）。這些非重復序列基因比對分析表明，與瘤背石磺轉錄本具有最高相似度的是海蝸牛（Aplysia californica）（47.1%），其次是光滑雙臍螺（Biomphalaria glabrata）（27.8%）、棒絡新婦蜘蛛（Nephila clavipes）（3.1%）、仿刺參（1.7%）和青螺（Lottia gigantea）（1.4%）（圖4c）。

圖4 瘤背石磺體腔細胞轉錄本序列與數據庫中已知序列比對結果Fig.4 Comparison of transcriptomic sequences from coelomocytes in Onchidium struma with the known sequences from different species in database

在GO 功能注釋中，21 036 個Unigenes 被注釋到3 個功能類別，分別為：分子功能、生物過程和細胞組成，并被進一步注釋為55 個子類。在這3 大功能類別中，得到注釋最多的子類是細胞過程、結合、單生物過程、代謝過程、催化活性、細胞、細胞組分和膜（圖5）。

圖5 瘤背石磺體腔細Unigenes 的GO 功能注釋Fig.5 Gene ontology (GO) functional annotation of Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

COG 數據庫比對結果顯示，共有7 294 個Unigenes 被注釋到26 個功能類別中（圖6）。其中，優勢類群為：“一般功能預測” “信號轉導機制” “翻譯后修飾、蛋白質折疊、分子伴侶” “未知功能” “轉錄、核糖體結構和發生” “胞內運輸分泌和囊泡轉運”和“轉錄”。在這些Unigenes 中，有302 個Unigenes 與“復制、復合、修復”和“防御機制”有關。

圖6 瘤背石磺體腔細胞Unigenes 的COG 統計圖Fig.6 Cluster of orthologous group (COG) functional annotation of Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

基于KEGG 數據庫，共有7 258 個Unigenes 被劃分為5 個類別：細胞過程、遺傳信息處理、環境信息處理、代謝和生物系統，共涉及32 個KEGG 注釋分類，得到最多注釋的為“信號轉導” “運輸和分解代謝”“內分泌系統” “翻譯” “折疊、分選和降解” “碳水化合物代謝” “消化系統” “細胞交流” “脂類代謝”和“免疫系統”，參與免疫系統的Unigenes 共有309 個（圖7）。

圖7 瘤背石磺體腔細胞Unigenes 的KEGG 注釋分類Fig.7 KEGG annotation of the assembled Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

4 討論

國內外對石磺科的研究起步較晚，目前的研究主要集中在繁殖生物學和生態學這兩個方面，而關于免疫學方面的研究甚少[23-24]。與其他海洋無脊椎動物一樣，體腔液是瘤背石磺進行病原防御的重要體液，其經離心后大致可分為由各類體腔細胞組成的底部沉淀和由多種免疫相關酶、補體因子和凝集素等體液免疫因子組成的體腔上清液兩部分[25]。本研究中，我們觀察到了3 種不同類型的體腔細胞，分別是變形細胞、球形細胞和色素細胞，這與海參體腔液中體腔細胞組成相類似[21]。在十足目甲殼動物和雙殼類軟體動物中，已鑒定出3 種主要的血細胞類型，即透明細胞、半顆粒細胞和顆粒細胞[26-27]。其中，透明細胞多呈規則圓形，且胞內不含顆粒，在海洋無脊椎動物的大部分種類中均有發現，包括香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）[28]、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）[29]、西施舌（Coelomactra antiquata）、波紋巴非蛤（Paphia undulata）、雙線紫蛤（Sanguinolaria diphos）[30]和橄欖蟶蚌（Solenaia oleivora）[31]等，除此之外，有人在蝦夷馬糞海膽（Strongylocrntrotus intermedius）[32]和紫海膽（Anthocidaris crassispina）[33]中發現了一類無色球形細胞，其細胞特征與透明細胞基本類似，因此也可歸為一類細胞進行命名劃分。San Miguel-Ruiz 和García-Arrarás[34]在褐石海參（Holothuria glaberrima）體壁上人工創傷進行研究，發現體壁創傷后，球形細胞和桑椹細胞的數量會逐漸增加，并且不斷遷移至傷口附近，重構細胞基質，進而促進傷口愈合。色素細胞來源于外胚層中被稱為神經嵴細胞的特化細胞，是兩棲動物、魚類、爬行動物、甲殼動物和頭足綱動物中含有生物色素的一類細胞[35]。色素細胞是調控動物體色的關鍵，與生物生存和繁殖活動密切相關[36]。在魚類中共報道6 種色素細胞，包括虹彩色素細胞、黃色素細胞、黑色素細胞、白色素細胞、紅色素細胞和藍色素細胞，但是色素細胞的組成因物種而異[37]。徐偉等[38]研究了幾種不同鯉鯽的鱗片色素細胞發現，組成鱗片的色素細胞有4 種：紅色素細胞、黃色素細胞、黑色素細胞和鳥糞素細胞，鳥糞素細胞又可被分為虹彩色素細胞和白色素細胞。在瘤背石磺體內，我們觀察到了黃棕色的色素細胞，推測其可能類似于魚類中的黃色素細胞，使瘤背石磺外觀呈土黃色，便于其藏匿于灘涂中，具有一定的保護作用。目前，不同類型的體腔細胞在瘤背石磺免疫系統中的具體作用尚不清楚，有待深入研究。

體腔液是低等水生動物的重要體液之一，含有凝集素、溶血素、酶、類補體物質等大量免疫因子[39]。酶是由活細胞產生的，對其底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質或RNA，是機體非特異性免疫的重要組成部分，動物體內酶水平可間接反應機體免疫能力[40]。在健康瘤背石磺體腔液內，各種酶均保持活性，并發揮各自的作用來維持機體的穩態。超氧陰離子（）是好氧生物機體代謝過程中必不可少的物質，在正常狀態下，自由基的產生和消除維持著動態平衡。當機體受到外來病原如細菌、病毒侵害時，機體會產生應激反應從而釋放大量活性氧，最終使機體發生細胞凋亡或壞死等損傷[41]。T-AOC、SOD 是機體重要的抗氧化酶，T-AOC 反映機體的總抗氧化能力；SOD 可以和過氧化氫酶（Catalase,CAT）協同作用，減少機體的氧化損傷[42]。PO 是一種重要的免疫相關酶，參與無脊椎動物的體液免疫防御過程，與黑色素產生、細胞黏附、包裹和吞噬有關[43]。磷酸酶根據最適pH 的不同，分為堿性磷酸酶AKP 和酸性磷酸酶ACP，它們是溶酶體酶的重要組成部分，具有水解、清除、消化異物的作用，從而達到免疫防御；并與生物的DNA、RNA、脂質和蛋白質的代謝有關，可以促進機體生長和提高免疫力[44-45]。在健康瘤背石磺體內，ACP 和AKP 以酶原的形式存在于體腔液中，ACP 的活性可以代表體腔液清除異物的能力[45]。本實驗揭示，自然狀態下瘤背石磺體腔液中存在的多種抗氧化及免疫相關酶的活性，這不僅為進一步檢測瘤背石磺在應激狀態下的免疫應答能力提供了對比，也為瘤背石磺抗氧化系統和免疫系統的研究提供了基礎數據。

楊鐵柱[46]在2020 年利用RNA-Seq 技術篩選出與瘤背石磺歸巢行為相關聯的生物節律性和環境感知性基因，為探討瘤背石磺在潮間帶灘涂區域適應性進化提供基礎數據。對于瘤背石磺而言，體腔細胞是其發揮非特異性免疫的重要載體，為了進一步剖析瘤背石磺體腔細胞的免疫防御分子機制，本實驗通過Illumina 平臺對瘤背石磺的體腔細胞進行測序與功能注釋，共獲得63 097 個Unigenes，數據含量大，基因信息豐富，可為未來瘤背石磺的研究奠定基礎。通過GO 功能注釋，有21 036 個Unigenes 被注釋到分子功能、生物過程和細胞組成3 個功能類別中，這與刺參體腔細胞轉錄組的數據高度相似[47]。基于Nr 數據庫對比，海蝸牛與瘤背石磺序列同源性最高，與Oskars等[48]的報道相似，其次是光滑雙臍螺、棒絡新婦蜘蛛、刺參和青螺，分別屬于軟體動物門、節肢動物門和棘皮動物門，瘤背石磺與不同物種間的同源性也證明了其獨特的進化地位。基于通路的分析有助于進一步闡明基因的生物學功能和相互作用機制，KEGG注釋表明，這些Unigenes 參與了機體的信號轉導、蛋白質翻譯、蛋白質轉換、免疫防御等各個過程，這將為進一步篩選免疫相關基因和信號通路提供指引。

5 結論

瘤背石磺體腔液內主要含有變形細胞、球形細胞和色素細胞3 種不同類型的體腔細胞，其中，球形細胞最多。此外，瘤背石磺的體腔液內含有多種抗氧化酶和免疫相關酶，它們發揮著各自的作用，共同維護機體健康。RNA-Seq 測序表明，從瘤背石磺體腔細胞中共組裝出63 097 個Unigenes，這些Unigenes 被成功注釋到GO、COG 和KEGG 數據庫中。如上結果為深入了解瘤背石磺進化地位及其免疫系統奠定理論基礎，為發展瘤背石磺人工養殖提供理論指導。