沙棘籽不同部位原花青素含量及抗氧化性研究

魏 璐，田建華，史 鵬

(山西省林業和草原科學研究院，山西 太原 030012)

沙棘(Hippophaerhamnoides)，胡頹子科灌木或喬木，別名醋柳，是極為珍貴的藥食同源植物，主要分布于歐亞大陸的溫帶高山區[1]。原花青素是沙棘的主要生物活性成分之一，具有多種生理功能[2,3]。筆者采用鹽酸-正丁醇法對沙棘籽不同部位的原花青素含量進行測定，并通過其對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除效果，分析評價其抗氧化性，以期為沙棘資源的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗材料包括沙棘原料(購自山西省某沙棘飲料廠)、原花青素標準品(HPLC≥95%，成都曼斯特生物科技有限公司)、甲醇、正丁醇、鹽酸、硫酸鐵銨。

試驗儀器包括JYL-C020E粉碎機(九陽股份有限公司)、Explorer pro分析天平(奧豪斯儀器有限公司)、HH數顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)、KQ-200VD型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、UV3100PC紫外-可見分光光度計(美普達儀器有限公司)、SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理

用簸箕從沙棘原料中分出沙棘籽、沙棘籽殼、提油沙棘籽渣(經超臨界CO2萃取)，分別于-50 ℃用冷凍干燥機干燥24 h，粉碎，過80目篩，備用。

1.2.2 原花青素標準曲線的繪制

配置濃度為0 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL的原花青素標準系列工作液。吸取原花青素標準系列工作液各1 mL，置于安瓿瓶中，加入鹽酸-正丁醇溶液6 mL、硫酸鐵銨溶液0.2 mL，混勻，用封口鉗將其密封，于沸水中加熱40 min后取出，立即置于冰水中冷卻至室溫，于546 nm波長處測定吸光度，顯色在1 h內穩定。以吸光度為縱坐標，原花青素濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3 原花青素含量測定

精密稱取樣品10 mg～100 mg，置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)20 min，放至室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，離心或靜置澄清后取上清液作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液1 mL，置于安瓿瓶中，按照標準曲線制作步驟執行，以只加鹽酸-正丁醇溶液和硫酸鐵銨溶液為空白對照。測定樣品吸光度，用標準曲線計算試樣中原花青素的含量，計算公式如下：

式中：X為試樣中原花青素的含量，g/100 g；c為反應混合物中原花青素的量，μg/mL；V為待測樣液總體積，mL；V1為樣液反應體積，mL；V2為樣液反應后總體積，mL；m為試樣質量，mg。

1.2.4 原花青素抗氧化性測定

1)DPPH自由基清除能力測定。取不同濃度的原花青素提取液1.0 mL，加入0.004%的DPPH溶液3 mL，充分混勻，在黑暗條件下靜置30 min，以無水乙醇作空白對照，相應濃度的VC和BHT作陽性對照，于517 nm波長處測定吸光度。每個樣品3次重復，取平均值。計算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=(A2-A1)/A2×100%。

式中：A1為樣品或陽性對照的吸光度，A2為空白對照的吸光度。

2)羥自由基清除能力測定。于比色管中分別加入7.5 mmol/mL硫酸亞鐵溶液1 mL、7.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，再加入不同濃度待測原花青素提取液1 mL，最后加0.8 mol/L過氧化氫溶液1 mL，35 ℃條件下水浴35 min，于510 nm波長處測定吸光度。空白對照以蒸餾水取代原花青素提取液,本底測試以蒸餾水取代過氧化氫，以VC和BHT作陽性對照。計算公式如下：

羥自由基清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%。

式中：A0為空白對照的吸光度；Ax為樣品或陽性對照的吸光度；Ax0為本底測試的吸光度。

3)超氧陰離子清除能力測定。在比色管中加入0.05 mol/L的Tris-HCl溶液(pH值為8.2)4.5 mL，于25 ℃下水浴保溫20 min，加入不同濃度的原花青素提取液0.1 mL和3 mmol/L的鄰苯三酚(用10 mmol/L的HCl配置)0.5 mL，混勻后于20 ℃條件下水浴6 min，再加入2滴8 mol/L的HCl終止反應，于320 nm波長處測定吸光度。空白對照以蒸餾水取代原花青素提取液，本底測試以蒸餾水取代鄰苯三酚，以VC和BHT作陽性對照。計算公式如下：

超氧陰離子清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100。

式中：A0為空白對照的吸光度，A1為樣品或陽性對照的吸光度，A2為本底測試的吸光度。

2 結果與討論

2.1 原花青素標準曲線

原花青素標準曲線見圖1。

圖1 原花青素標準曲線

由圖1可知，原花青素標準曲線方程為y=0.004 6x-0.018 7，其相關系數R2=0.994 1。

2.2 沙棘籽不同部位原花青素含量

沙棘籽不同部位原花青素含量見第6頁圖2。

由圖2可知，沙棘籽不同部位原花青素含量不同。原花青素含量最高的部位是沙棘籽殼，含量為66%；其次為沙棘籽，含量為45%；提油沙棘籽渣的原花青素含量最低，僅為8%左右。這是由于在超臨界CO2萃取過程中，沙棘籽渣中的大部分原花青素隨夾帶劑被萃取，僅有少量留在殘渣中。

圖2 沙棘籽不同部位原花青素含量

2.3 沙棘籽不同部位原花青素的抗氧化能力

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素對DPPH自由基的清除能力見圖3。

圖3 沙棘籽不同部位原花青素對DPPH自由基的清除能力

由圖3可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都有清除DPPH自由基的作用。3種原花青素提取液在10 μg/mL時已經具有清除DPPH自由基的能力，隨著提取液濃度的增大，其對DPPH自由基的清除率也增大。當提取液濃度增大至某一值時，其對DPPH自由基的清除率達到最大值。當提取液濃度達到100 μg/mL時，3種樣品原花青素對DPPH自由基的清除率和VC相近，約為95%左右。3種樣品處于同一濃度時，其原花青素對DPPH自由基的清除能力為提油沙棘籽渣>沙棘籽殼>沙棘籽，這是由于不同樣品中原花青素的聚合度不同。同常見的抗氧化劑相比，沙棘籽不同部位原花青素對DPPH的清除效果弱于VC，強于BHT。

2.3.2 對羥自由基的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素對羥自由基的清除能力見圖4。

圖4 沙棘籽不同部位原花青素對羥自由基的清除能力

由圖4可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都具有清除羥自由基的作用。其中，沙棘籽殼原花青素提取液對羥自由基的清除率呈緩慢增長趨勢，當提取液濃度由20 μg/mL增長至600 μg/mL時，清除率由53%增加至90%，且沙棘籽殼原花青素提取液對羥自由基的清除率明顯高于VC和BHT。沙棘籽和提油沙棘籽渣中原花青素對羥自由基的清除率僅在低濃度下呈現一定的增長，當濃度增加至100 μg/mL后趨于平緩，沙棘籽原花青素的羥自由基清除率維持在21%～31%，提油沙棘籽渣原花青素的羥自由基清除率維持在34%～45%，兩者對羥自由基的清除效果均強于BHT，弱于VC。

2.3.3 對超氧陰離子的清除能力

沙棘籽不同部位原花青素對超氧陰離子的清除能力見圖5。

圖5 沙棘籽不同部位原花青素對超氧陰離子的清除能力

由圖5可知，沙棘籽不同部位原花青素提取液都有清除超氧陰離子的作用，清除效果隨濃度的增加而增加。樣品和陽性對照在濃度為0.1 mg/mL時，對超氧陰離子的清除效果相近，清除率約為10%～20%；濃度為0.8 mg/mL時，對超氧陰離子的清除效果相差較大。沙棘籽殼原花青素的超氧陰離子清除率可達68.9%，高于其余樣品和陽性對照，沙棘籽、提油沙棘籽渣原花青素的超氧陰離子清除率約為43%～53%，低于VC，高于BHT。

3 結論

本研究結果表明，沙棘籽不同部位的原花青素含量為沙棘籽殼>沙棘籽>提油沙棘籽渣。沙棘籽不同部位原花青素均具有清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的能力，且清除能力在一定范圍內和樣品濃度呈正相關關系，清除效果優于常見的抗氧化劑BHT，但稍弱于VC，其中，沙棘籽殼中原花青素對羥自由基和超氧陰離子的清除效果優于VC。總體而言，沙棘籽中的原花青素具有較強的體外抗氧化能力，該資源的開發利用在生物醫藥領域有著巨大的應用潛力。