利用高效液相色譜法測定山西中條山五味子2種有機酸的含量

張彩紅，史 鵬，楊延青，常茂林

(山西省林業(yè)和草原科學研究院，山西 太原 030012)

五味子為常用中藥材，對失眠、多汗、腹瀉、疲勞、神經(jīng)衰弱等疾病具有一定的治療效果[1,2]。有研究表明，五味子中含有豐富的有機酸，包括檸檬酸、蘋果酸[3]等。山西中條山太寬河保護區(qū)分布的野生五味子資源豐富，筆者通過高效液相色譜法測定其果實中有機酸的含量，以期為促進山西省野生五味子資源的合理開發(fā)和利用提供理論支持。

1 試驗材料

1.1 材料

試驗材料為山西中條山太寬河保護區(qū)內(nèi)分布的野生五味子果實，選擇6個不同產(chǎn)地的優(yōu)樹果實，分別標記為sj-001、sj-002、sj-003、sj-004、sj-005、sj-006。

1.2 試劑

試驗試劑包括檸檬酸標品(中國食品藥品檢定研究院)、L-蘋果酸標品(中國食品藥品檢定研究院)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、H3PO4(分析純)、HCl(分析純)、無水乙醇(分析純)。試驗用水為經(jīng)超純水機處理的一級水。

1.3 儀器

試驗儀器包括Aglient 1260 Ⅱ高效液相色譜儀(DAD檢測器)，美國安捷倫公司；混勻振蕩器，Heidolph公司；超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；超純水機(Milli-Q)，Millipore公司；電子天平(精度0.000 1 g)，賽多利斯公司。

2 試驗方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18(150.0 mm×4.6 mm，5 μm)，美國安捷倫公司。流動相A為乙腈溶液，流動相B為0.2%的H3PO4溶液，梯度洗脫15%～60% A(0 min～25 min)、15% A(30 min)。流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。紫外檢測器檢測波長為220 nm。

2.2 標準儲備液的制備

準確稱取L-蘋果酸標品、檸檬酸標品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到10 mg/mL的儲備液，于4 ℃下避光保存。取適量儲備液，置于10 mL容量瓶中，用流動相(A∶B=15∶85)稀釋至刻度，搖勻。逐級稀釋成系不同濃度的對照品。

2.3 供試溶液的制備

將五味子樣品烘干、粉碎、過篩后備用。準確稱取1.000 0 g的五味子樣品于三角瓶中，加入20 mL提取劑(甲醇和H2O的體積比為60∶40)，超聲振蕩提取30 min，離心，收集殘渣進行再提取。取出提取液冷卻至室溫，混合2次提取液,定容至50 mL，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，待上機。

2.4 方法學驗證

1)系統(tǒng)適用性試驗。精密吸取10 μL混合對照品溶液，按2.1項的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

2)線性關(guān)系考察。配置50 μg/mL、100 g/mL、200 μg/mL、500 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL的混合對照品溶液，按2.1項的色譜條件進行測定，以峰面積為Y，對照品溶液濃度為X，進行回歸分析。

3)精密度試驗。精密吸取同一濃度的對照品溶液，按2.1項的色譜條件，連續(xù)進樣測定5次，分別計算2種有機酸的峰面積RSD。

4)重復(fù)性試驗。精密稱取同一五味子樣品5份，按2.3項的方法制備供試溶液，按2.1項的色譜條件進行測定，分別計算2種有機酸的峰面積RSD。

5)穩(wěn)定性試驗。精密稱取同一五味子樣品1.000 0 g，按2.3項的方法制備供試溶液，按2.1項的色譜條件進行測定，每8 h進樣1次，共測定5次，分別計算2種有機酸的峰面積RSD。

6)加樣回收率試驗。精密稱取5份1.000 0 g的五味子樣品，按照2.3項的方法制備供試溶液，按2.1項的色譜條件進行測定，分別計算2種有機酸的加樣回收率和RSD。

2.5 五味子有機酸含量的測定

將6個產(chǎn)地的五味子樣品分別按2.3項的方法制備供試溶液，再按2.1項的色譜條件進樣10 μL，采集色譜圖。根據(jù)色譜圖中待測成分的峰面積計算6個供試品中的有機酸含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學驗證結(jié)果

1)系統(tǒng)適用性。對照品溶液的L-蘋果酸和檸檬酸HPLC圖譜見圖1和圖2。

圖1 對照品溶液的L-蘋果酸HPLC圖譜

圖2 對照品溶液的檸檬酸HPLC圖譜

由圖1和圖2可知，混合對照品溶液中L-蘋果酸和檸檬酸的分離度均大于1.5，系統(tǒng)適用性良好。

2)線性關(guān)系。2種有機酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)與線性范圍見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

由表1可以看出，L-蘋果酸的回歸方程為Y=0.444 3X+0.637 7，檸檬酸的回歸方程為Y=0.407 8X+3.150 3，2種有機酸的峰面積與對照品溶液濃度線性關(guān)系良好，R2均大于0.999 0。

3)精密度。精密度試驗中，2種有機酸的峰面積RSD均為1.45%～2.63%，表明儀器精密度良好。

4)重復(fù)性。重復(fù)性試驗表明，供試溶液2種有機酸的峰面積RSD均為1.21%～2.25%，表明此方法的重復(fù)性良好。

5)穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗中，供試溶液2種有機酸的峰面積RSD均為0.89%～1.60%，表明供試溶液在40 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

6)加樣回收率。2種有機酸的加樣回收率和RSD見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 %

由表2可知，2種有機酸的平均回收率均大于97%，RSD達到1.7%以上，加樣回收率測定結(jié)果符合相關(guān)要求。

3.2 五味子有機酸含量

山西中條山太寬河保護區(qū)6個產(chǎn)地的五味子有機酸高效液相色譜圖見圖3。根據(jù)色譜圖中待測成分峰面積計算6種供試品中的L-蘋果酸含量和檸檬酸含量，結(jié)果見表3。

由表3可知，山西中條山野生五味子中的L-蘋果酸和檸檬酸含量平均為(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g。不同產(chǎn)地五味子的L-蘋果酸和檸檬酸含量存在極顯著性或顯著性差異。其中，sj-005的L-蘋果酸含量最高，為(39.565±2.338) mg/g，sj-005和sj-006的檸檬酸含量最高，分別為(89.437±4.808)mg/g和(87.883±5.570) mg/g。

圖3 五味子樣品高效液相色譜圖

表3 五味子樣品中L-蘋果酸和檸檬酸含量 mg/g

4 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，高效液相色譜法測定有機酸的液相色譜條件應(yīng)設(shè)置為流動相A為乙腈溶液，流動相B為0.2%的H3PO4溶液，梯度洗脫為15%～60% A(0 min～25 min)、15% A(30 min)，該方法具有分析速度快、線性范圍寬、精密度高、準確度好等優(yōu)點。用此方法測得山西中條山太寬河保護區(qū)6個產(chǎn)地五味子的L-蘋果酸和檸檬酸含量平均為(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g，不同產(chǎn)地五味子的L-蘋果酸和檸檬酸含量存在極顯著性或顯著性差異。