定西漿水微生物污染調查和乳酸菌的初步鑒定

陳亞軍 孫梓軒 王文莉

以定西漿水為研究材料，用GB4789系列微生物檢驗標準檢測漿水中的微生物，并采用稀釋涂布法分離篩選漿水中的乳酸菌群，利用生理生化反應初步鑒定其種屬。結果在定西漿水中共檢測出蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和2種致病微生物，并從定西漿水中初步鑒定乳酸菌分屬于乳桿菌屬Lactobacillus、明串珠菌屬Leuconostoc和片球菌屬Pediococcus，說明定西漿水的應用潛力巨大，但致病菌的檢出說明漿水有受微生物污染的潛在風險。

漿水是用糧食、蔬菜等混合后發酵而成的酸味地方特色食品，是西北的一道獨特傳統美食，因其制作簡單、原料親民、成本低廉而深受北方尤其是山西、陜西、甘肅、寧夏等地人民的喜歡。已有研究表明，漿水中含有大量微生物，乳酸菌、醋酸菌和酵母菌是漿水發酵過程中的主要菌群，其中尤以兼性厭氧乳酸菌為主要優勢菌群，且大部分乳酸菌具有一定的益生活性，但是由于消費區域性限制以及漿水制作和存儲的不確定性因素較多，使得目前漿水主要以家庭制作為主，發酵質量和衛生狀況無法得到有效保障，這也是阻礙漿水向規范化和標準化生產的主要因素。目前研究較多的甘肅漿水是天水漿水和蘭州漿水，且研究內容大多集中在對其中的乳酸菌進行分離鑒定和特性研究，很少從食品安全角度出發，檢測漿水中的微生物污染狀況。本研究將以定西市不同縣區的市售漿水為研究對象，以GB4789食品微生物檢驗系列標準為依據，分析漿水的食品衛生狀況，并對其發酵過程中的乳酸菌進行初步分離，為定西漿水的規范化生產加工提供技術支持，并為定西漿水中乳酸菌的進一步分析研究提供理論基礎。

1. 材料和方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 樣品采集

從甘肅省定西市各縣區的不同場所取樣已經發酵完好、正常銷售的漿水樣品，無菌采集至無菌袋后低溫運輸至實驗室進行益生菌的分離篩選，共采集樣品40份。

1.1.2 培養基和試劑

NaCl、Na2HPO4、KH2PO4（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司;MRS （Man Rogosa Sharpe）培養基、MC（ModifiedChalmers）培養基：北京陸橋生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-350B智能型生化培養箱：上海瑯試驗設備有限公司;MLS-3781L-P立式高壓滅菌器：松下健康醫療器械（上海）有限公司;EX-30顯微鏡：寧波舜宇;C-1厭氧培養罐、厭氧產氣袋：日本三菱。

1.3 方法

1.3.1 漿水中微生物的檢測項目、檢測方法和標準

定西漿水中微生物的檢測項目見表1，檢測方法按照食品安全國家標準食品微生物學檢驗（GB 4789）標準執行。

1.3.2 漿水中乳酸菌的初步分離

用生理鹽水稀釋漿水樣品，并選取適宜稀釋度的樣品菌液涂布于MRS和MC培養基中，36℃培養72h，其中MRS進行厭氧和好氧培養。培養結束后，觀察并記錄培養基上不同菌落的形狀、大小、顏色、光滑度、邊緣形狀等形態特征，挑取不同形態的單菌落進行進一步純化培養和染色鏡檢。

1.3.3 菌株的生理生化鑒定

將菌株純化培養后，進行常規的生理生化鑒定，生理生化項目有：硝酸鹽還原實驗、明膠水解實驗、酪蛋白分解實驗、硫化氫產生實驗、MR-VP實驗、觸酶實驗、糖發酵實驗（葡萄糖、核糖、果糖、木糖），記錄各生理生化結果。

2. 結果與分析

2.1定西漿水中大腸菌群和食源性致病菌檢測結果

本次共抽取定西地區漿水樣本40份，共檢出食源性致病菌10株，包括9株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為22.5%;1株金黃色葡萄球菌，檢出率為2.50%;大腸菌群、沙門氏菌、李斯特氏菌、副溶血性弧菌均未檢出，檢測結果見表2。

本次檢測中的蠟樣芽孢桿菌檢出率最高，其為條件致病菌，主要通過產生毒素、溶血素等物質從而有引起食源性疾病的風險。目前認為該菌含量高于105CFU/g（mL）是引起食物中毒的診斷標準。本次蠟樣芽孢桿菌的檢出值均小于103CFU/mL，低于引起食物中毒的限量要求，但是也有相關報道，蠟樣芽孢桿菌在103CFU/g（mL）的含菌量下依然有引發感染的可能性，因此不能忽視由該菌污染導致的食品安全問題。金黃色葡萄球菌是引起細菌性食物中毒的主要病原菌，其產生的腸毒素具有對熱穩定（耐高溫）的特性，即使高溫處理依然不能破壞其毒性，在菌體死亡后毒素依然可能存在于食物中對人體造成危害。本次檢出的1株金黃色葡萄球菌數量為670CFU/mL，腸毒素檢測結果為陰性，說明定西漿水倍金黃色葡萄球菌污染的風險較小。

2.2 漿水中乳酸菌的初步分離

根據菌落表型特征，本研究從MRS和MC培養基中共分離出菌株18株。菌落形態、分離培養基和革蘭氏染色結果見表3。菌落形態觀察結果顯示，在MC培養基中所分離菌落大部分為圓形、粉紅色較小菌落;MRS培養中主要分離到圓形、乳白色不透明較大菌落，革蘭氏染色結果顯示所分離菌株大部分為G+桿狀細菌、少數為球形。

2.3 菌株生理生化特性及初步鑒定

結合菌株生長特性、菌落形態、革蘭氏染色鏡檢結果和生理生化反應。查詢《伯杰細菌鑒定手冊》以及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》，對所分離菌種的初步鑒定。其中，J3、J13和JR12硝酸鹽反應陽性，不符合乳酸菌反應特征;J10、J11、JR2生理生化反應一致，但和乳桿菌屬Lactobacillus的生化反應相差較大，所以以上菌株初步鑒定為非乳酸菌;J7和JR10為球菌，根據生化反應，初步鑒定為明串珠菌屬Leuconostoc和片球菌屬Pediococcus;其余菌株初步鑒定為乳桿菌屬Lactobacillus，其中J14和JR16生化反應一致，初步鑒定為Lactobacillus plantarum;JR6、JR8初步鑒定為Lactobacillus delbrueckii;R7、JR9、JR13初步鑒定為Lactobacillus fermentum;JR14初步鑒定為Lactobacillus amylolyticus;JR15初步鑒定為Lactobacillus paracasei;JR11無法鑒定到種。本次定西漿水中乳酸菌的初步鑒定結果，和現有文獻報道的基本一致。

3. 討論和結論

由于漿水的制作和儲存過程受不同因素，如發酵時間、原材料、溫度等的影響較大，而且現階段漿水的制作一直停留在家庭自制或小作坊式的制作階段，加工過程粗放，環境和人員衛生無法有效控制，因此，定西漿水目前還無法實現大規模、標準化、產業化的生產，導致漿水的衛生質量得不到有效保障，而且近幾年從食品衛生方面研究漿水的報道幾乎沒有。通過本次研究，我們從定西漿水中檢測出了蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌2種致病菌，且蠟樣芽孢桿菌檢出率較高，達到了22.50%，說明漿水在制作和加工過程中存在被有害菌污染的可能，是漿水大規模規范化生產需要解決的首要問題。

本研究對定西漿水中的乳酸菌進行了分離和初步鑒定，主要是乳桿菌、片球菌和明珠串菌，以乳桿菌數量最多。已有研究表明，漿水發酵過程分為三個時期，前期（第1-3天）的優勢菌群為酵母菌、醋酸菌、小片球菌和明串珠菌，中期（第4-6天）主要以植物乳桿菌和短乳桿菌為主，后期（7-9天）以酵母菌數量最多。其中發酵第5-7天是漿水食用的最佳日期，這和本次鑒定結果基本一致。已有研究表明，乳酸菌的功能性主要包括維持腸道菌群平衡，提高免疫力;降解膽固醇、亞硝酸鹽和重金屬;產生細菌素用于病原微生物的拮抗，如植物乳桿菌產生的桿菌素可作為天然生物防腐劑使用;提升食品營養價值和改善食品風味等作用。

本研究結果說明，定西漿水中存在大量具有特征功能性的乳酸菌，表明定西漿水具有巨大的開發應用前景，但通過檢測同時發現漿水中還存在著一定數量的致病菌，表明現階段定西漿水的制作過程存在較大問題，制約著定西漿水的大規模規范化應用。

基金項目：

甘肅省市場監督管理局科技計劃資助（SSCJG-SP-201917）。