氮磷添加對高寒草地土壤養分和相關酶活性的影響

盛基峰 ，李垚, ，于美佳, ，韓艷英 , ，葉彥輝 ,

1.西藏農牧學院高原生態研究所，西藏 林芝 860000；2.西藏高原森林生態教育部重點實驗室；西藏 林芝 860000；3.西藏高寒植被生態安全重點實驗室，西藏 林芝 860000；4.西藏農牧學院資源與環境學院，西藏 林芝 860000

在陸地生態系統中，氮和磷是限制植物生長的兩種主要元素（Harpole et al.，2011）。在過去的一個世紀里，由于化石燃料燃燒、農業施肥和粉塵或灰燼的產生等人類活動，全球生態系統的氮和磷輸入大幅增加（Wang et al.，2015）。據預測，到2050年，全球大氣氮沉降將增至 200 Tg（Moorhead et al.，2013）。過量的氮沉降會對氮循環和平衡產生負面影響，影響土壤養分狀況、土壤微生物多樣性和植被生產力（Song et al.，2020）。適量的氮添加可以改善土壤環境，使土壤肥力增強，方運霆等（2004）通過模擬大氣氮沉降發現，大氣中的氮沉降不僅能夠顯著提高土壤中無機氮的含量，而且伴隨氮沉降時間的延長，土壤中無機氮含量也會呈現出顯著增加的趨勢。張進霞（2014）對紫花苜蓿（Medicago sativa）的NP添加實驗有相同結論，養分添加顯著提高土壤堿解氮含量。磷是自然界中最重要的元素之一，參與生物細胞膜的合成和酶的活化（Vance et al.，2003）。土壤中的磷很容易與土壤中的鋁和鐵的氧化物以及氫氧化物進行化學反應，強烈抑制了其從土壤中的釋放，導致磷利用率低（Li et al.，2021）。以往的研究表明，土壤的氮、磷含量在自然界中處于一種動態平衡過程，大氣氮沉降使土壤中氮元素含量增加，使影響植物生長發育的限制因素由氮元素轉換為磷元素；反之，當土壤中磷含量較高時，土壤中就會出現氮限制（Berendse et al.，2001）。近些年來，通過對不同草地生態系統的研究發現，施肥處理對磷元素的影響結果并不一致。Widdig et al.（2020）報告稱，在溫帶草原，氮和磷的添加對土壤全磷濃度沒有顯著影響，而其他研究報告稱，氮的添加顯著降低了溫帶草原的土壤全磷和有效磷（Gong et al.，2020）。

土壤酶作為土壤生物各種生命化學反應的催化物質，維持著土壤生態系統營養物質的正常循環和平衡（Yu et al.，2016）。土壤酶是土壤營養物質循環的主要驅動因子，其活力是衡量土壤肥力和評價土壤生態系統穩定性的重要指標（Yang et al.，2017）。一些研究表明，添加氮對細胞胞外酶活性具有中性影響，但P添加對胞外酶活性有負面影響（Jing et al.，2016）。Wu et al.（2022）對高寒草地養分添加的研究表明，氮和磷添加顯著降低了葡萄糖苷酶催化效率。吳建波等（2021）對藏北高寒草原土壤氮添加發現，土壤pH對土壤酶不存在顯著影響，且氮添加降低了碳相關水解酶活性，提高脲酶活性。

土壤有機碳是指土壤中各種正價態的含碳有機化合物，是土壤極其重要的組成部分，不僅與土壤肥力密切相關，而且對地球碳循環有巨大的影響（曹石榴，2019），既是溫室氣體“源”，也是其重要的“匯”。高寒草地是青藏高原主要分布廣泛的草地類型之一，其有機碳儲量約為3.02 Pg。受青藏高原惡劣的氣候條件和營養物質（主要是氮和磷）限制，高寒草地對環境變化非常敏感，特別是全球變暖和氮磷的增加（Fayiah et al.，2020）。例如，氣候變暖導致冰川急劇退縮和多年凍土快速融化，直接導致高寒草地退化和有機碳儲量減少（Liu et al.，2018）。NP添加顯著影響高寒草地碳循壞和有機碳儲量，與添加N和NP相比，P添加土壤有機碳存儲最低（Luo et al.，2020）。為研究高寒草地土壤有機碳固存的關鍵驅動因素及其影響因素，從而防止草地退化或維持高寒草地的穩定。本研究通過以藏東南色季拉山高寒草地土壤為研究對象，設置長期外源養分添加樣地，分析土壤養分含量和酶活性對NP添加的響應，同時分析土壤碳、氮、磷與蔗糖酶、葡萄糖苷酶、脲酶之間的交互作用，旨在揭示高寒草地土壤養分和酶活性的內在關系，探究土壤碳氮磷元素在氮沉降背景下如何響應，為高寒草地的保護提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

西藏色季拉山位于念青唐古拉山與喜馬拉雅山接合處的林芝縣境內，屬念青唐古拉山余脈，山體位于 93°12′—95°35′E，29°10′—30°15′N。山體走向主要為西北-東南，形成較大范圍的東西坡面。本試驗選定色季拉山西坡（29°38′8″N，94°37′26″E，平均坡度 21.4°）海拔 4400 m 高寒草地為試驗樣地，樣地視野開闊，蓋度較大。樣地屬濕潤山地暖溫帶和半濕潤山地溫帶氣候，年平均氣溫為?0.73 ℃，年平均降水為1134.1 mm，降水主要集中在4—10月，無霜期180 d，平均相對濕度60%—80%，土壤以山地棕壤和酸性棕壤為主，草地主要植被為五葉雙花委陵菜（Potentilla bifloravar.lahulensisTh.Wolf）、白心球花報春（Primula atrodentataW.W.Sm.）和藍鐘花（Cyananthus hookeriC.B.Clarke），占樣地面積80%。施肥前土壤理化性質見表1。

表1 試驗樣地土壤原始狀況Table 1 Original soil conditions of the test plot

1.2 試驗設計

本試驗樣地所在的草地采用封閉管理，減少外界環境的干擾。本試驗共有4個處理，分別為CK（對照組，自然環境條件）、N（硝酸銨NH4NO3，15 kg·hm?2·a?1）、P（過磷酸鈣 Ca(H2PO4)2，75 kg·hm?2·a?1）、NP（NH4NO315 kg·hm?2·a?1N、Ca(H2PO4)275 kg·hm?2·a?1P）。樣地內設置 3 個重復區組，每個區組內布設4個大小為3 m×3 m的樣方，樣方與樣方之間設置5 m的緩沖帶，區組與區組之間設置10 m的緩沖帶。本試驗研究區于2019年5月進行實地考察布設，于8月初植被生長旺盛期進行施肥處理，施肥時選擇天氣晴朗的早上，每次施加的水量大約相當于當地2.0 mm的自然降水量，CK添加等量的水。施肥采用人工背負式噴霧器噴灑的方式，將NH4NO3和Ca(H2PO4)2均勻噴灑在土壤表面。

1.3 土壤取樣與測定

土壤樣品在2020年8月施肥前（施肥1年后）進行收集，以便于測定施肥1年后土壤養分和酶活性變化情況。在每個樣方內用直徑5 cm的土鉆采用五點取樣法采集0—20 cm表層土壤，將同一樣方內5個樣品均勻混合為1個土壤樣品（共12份鮮樣）。利用2 mm的網篩去除土壤樣品中較大的根和石頭，冷藏保存帶回實驗室，將樣品自然風干后測定土壤的理化性質，測量方法見表2（范珍珍等，2018；文旻等，2021；吳建波等，2021）。

表2 土壤理化性質和酶活性測定方法Table 2 Methods for determination of soil physical and chemical properties and enzyme activity

1.4 數據統計與處理

應用Excel 2019、SPSS 25結合Sigmaplot 14.0和Origin 2022對獲取的數據進行整理和統計分析。采用多因素方差分析檢測N添加、P添加、NP混合添加對土壤養分和酶活性的影響。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法分別進行各試驗處理間差異顯著性檢驗及多重比較。應用Origin繪圖。

2 結果與分析

2.1 土壤pH

本試驗中P和NP添加處理均顯著降低了高寒草地土壤的pH值（P<0.05）（圖1），各添加均使土壤酸化程度加深，其中P添加處理最低（4.8）。

圖1 氮磷添加對土壤pH的影響Figure 1 Effects of nitrogen and phosphorus addition on soil pH

2.2 土壤養分

圖2a顯示，NP添加與對照相比顯著促進了土壤有機碳含量（P<0.05），具體表現為在NP處理下有機碳含量最高，提高了63.50%，N、P單獨處理次之，分別提高了50.86%、38.33%，相比于單一添加，只有在氮磷混合添加下對土壤有機碳含量影響最大。圖2b—d顯示，N、P添加與對照相比顯著增加了土壤全氮含量（P<0.05），具體表現為在N添加下全氮最高，提高了59.14%；P、NP添加次之，分別提高了40.86%、11.11%。氮磷共施減弱了氮肥的影響，使N處理下全氮含量顯著高于NP添加。施肥處理下，土壤銨態氮和硝態氮含量顯著增加（P<0.05）。在N添加下土壤銨態氮含量與硝態氮含量均達到最高，相比于 CK分別增加了47.58%、333.85%。不同處理下銨態氮含量的整體表現為 N>NP>P>CK，硝態氮含量整體表現為N>P>NP>CK。圖2e、f顯示，不同處理下土壤全磷含量分別為 0.71、0.74、0.69、0.84 g·kg?1。NP 添加下顯著促進全磷含量（P<0.05），提升幅度為19.41%；在N添加下土壤有效磷含量最高，增加了59.68%；P、NP添加下分別增加了 25.25%和38.85%；有效磷含量整體表現為N>NP>P>CK。

圖2 氮磷添加對土壤養分含量的影響Figure 2 Effects of nitrogen and phosphorus addition on soil nutrient content

2.3 土壤酶活性

圖3a、b顯示，不同施肥處理均顯著促進蔗糖酶和葡萄糖苷酶活性（P<0.05），與CK相比，P添加下土壤碳相關酶增幅較小，分別增加了24.96%、20.06%。蔗糖酶活性在 NP添加下最高，增加了92.63%，N添加下增加了81.92%。葡萄糖苷酶活性在N添加下最高，增加了71.94%，NP添加下增加了53.08%。圖3c顯示，在施肥處理下土壤脲酶活性均顯著高于CK處理（P<0.05），且P添加下增幅最大，增加了140.73%，N和NP添加下分別增加了58.13%、115.31%。

圖3 氮磷添加對土壤蔗糖酶、葡萄糖苷酶和脲酶活性的影響Figure 3 Effects of nitrogen and phosphorus addition on activity of soil sucrase, glucosidase and urease

2.4 土壤養分與酶活性的相關性分析

相關性分析表明（表3），pH與全氮、有機碳與全磷和有效磷、全氮與銨態氮、硝態氮與葡萄糖苷酶呈現顯著正相關（P<0.05）。pH與銨態氮、硝態氮、有效磷、葡萄糖苷酶，有機碳與蔗糖酶和葡萄糖苷酶，全氮與硝態氮，銨態氮與硝態氮、有效磷和葡萄糖苷酶，硝態氮與有效磷，葡萄糖苷酶與有效磷、蔗糖酶，均呈現極顯著正相關（P<0.01）。脲酶與pH、有機碳、銨態氮、硝態氮、有效磷、葡萄糖苷酶呈現極顯著負相關（P<0.01）。

表3 不同處理后土壤性質Pearson相關性分析Table 3 Pearson correlation analysis of soil properties after different treatments

3 討論

3.1 氮磷添加對土壤pH和養分的影響

土壤酸堿度是影響土壤肥力的因素之一，與土壤中的大部分化學反應以及各種生物過程均有極大的關聯，其值大小主要由土壤水溶液中氫氧根離子與氫離子的濃度決定（Li et al.，2021）。本研究中施肥處理均降低了高寒草地土壤的pH值（圖1），與大多數實驗結果一致（蘇潔瓊等，2014；劉紅梅等，2018），可能是由于銨態氮通過細菌硝化作用向土壤中釋放更多的氫離子，從而降低了土壤的pH值。

有機碳是植物生長發育的必需元素，是植物有機質的重要組分之一。研究表明土壤中施加有機物可以給微生物供給足夠的底物，加速有機碳的礦化，釋放更多的活性碳組分促進土壤碳循環（趙曉琛等，2016）。本研究中，施肥處理均顯著增加土壤有機碳含量（圖2a），且NP合施處理有機碳含量最高，這與翟珈瑩（2020）在青藏高原0—20 cm土層研究結果相一致，可能由于氮、磷含量處于一種動態平衡過程，氮添加下土壤氮含量增加，打破了氮磷平衡，使磷限制更加明顯，說明NP合施可以緩解由于單獨施氮造成的磷素限制。史曉鵬（2018）研究了 N（70 kg·hm?2·a?1）、P（17、34 kg·hm?2·a?1）和 NP 混合添加處理對苜蓿的影響，發現施肥均增加了有機碳含量。然而，Luo et al.（2019）和Li et al.（2020）研究均表明，氮磷富集加速青藏高原高寒草地土壤有機碳分解，降低了土壤總有機碳庫。

土壤全氮包括有機氮和無機氮，是土壤中各種形態氮元素含量總和（王?；鄣?，2004）。硝態氮與銨態氮在植物生長和發育過程中以離子的形式直接被植物所吸收利用，其在土壤中含量將直接影響植物群落生產力的變化趨勢（Liu et al.，2022）。葉彥輝等（2017）在高寒草地進行的氮添加試驗與本研究結果一致，一定量的氮添加可以提高土壤中全氮含量。相關性分析表明，pH與全氮呈現顯著正相關關系，與銨態氮和硝態氮呈現極顯著正相關關系，養分添加后pH的改變是氮元素含量變化的原因之一。本研究中不同施肥處理下全氮、銨態氮和硝態氮變化趨勢相似（圖2b—d），均在N添加下增幅最大，氮輸入對土壤環境改變較大。此外，在N添加下硝態氮變化較銨態氮變化大，Fu et al.（2017）對高寒草地綜合分析得出一致結論，其原因有兩種可能，一是高寒植物對銨態氮的利用率要高于硝態氮，二是不同植物類型對銨態氮和硝態氮養分吸收不同，當銨態氮含量達到植物需求后多余的量通過硝化作用轉化為硝態氮。本研究發現，氮磷混施下土壤全氮和硝態氮含量低于氮和磷添加處理，這可能是氮磷混施下植物生長加快，消耗了土壤中無機氮（蘇渝欽等，2016）。

本研究發現，土壤全磷含量僅在NP添加下顯著增加（圖2e），高寒草地氮元素缺乏且氮磷比失衡，單獨的N、P添加對土壤全磷無顯著影響，與劉姝萱等（2022）對荒漠草原和Widdig et al.（2020）在溫帶草原研究結果一致。有效磷是土壤中可被植物吸收的磷組分，本研究中有效磷變化顯著，各處理均呈現增加趨勢（圖2f），原因可能是養分輸入提高了微生物和磷相關酶的活性，磷相關分解酶活性的提高增強了微生物對土壤有機質的分解，加快了土壤中磷元素的轉換過程，從而提高有效磷含量（魏金明等，2011）。Hu et al.（2022）通過Mate分析發現環境因素中 pH、海拔、年平均溫度和年平均降水量顯著影響有效磷含量，因此，環境因素是不同地區磷元素研究結果不同的重要原因。對鄱陽湖苔草研究表明，N添加對濕地土壤全磷及有效磷含量影響均不明顯，研究區的土壤周期性淹水使土壤有機質分解相對較緩，土壤磷含量相對較高（文旻等，2021）。本研究中N、P添加下全磷含量變化指示了高寒草地養分限制因素，有效磷是土壤中可被植物吸收的磷組分，有效磷含量變化表明高海拔下進行施肥處理有利于地上植被生長。

3.2 氮磷添加對土壤酶活性的影響

土壤蔗糖酶和葡萄糖苷酶均是主要的碳獲得酶，是土壤碳循環過程的主要指標。蔗糖酶能通過水解形成果糖和葡萄糖，葡萄糖苷酶可以通過水解作用生成葡萄糖（Zi et al.，2022）。本研究各處理下蔗糖酶和葡萄糖苷酶變化趨勢相同，均在N和NP添加下促進效果最大，P添加對土壤碳獲取酶影響較小。相關性分析結果表明（表3），蔗糖酶和葡萄糖苷酶均與有機碳呈現極顯著正相關關系，這可能是由于養分增加，植物根系生長，導致土壤碳有效性不足，增加了微生物對碳的需求，改變了微生物對養分獲取策略，增加了蔗糖酶活性和葡萄糖苷酶活性，從而提高酶活性，然而，由于施肥量不同導致促進效果不同（Liu et al.，2022；趙曉琛等，2016）。碳獲取酶活性研究有不同結論，孫亞男等（2016）在高寒草地研究結果與本研究不同，4年NP添加下各處理對0—10 cm和10—20 cm土層蔗糖酶活性均沒有顯著影響，這與施肥時引入碳元素有關。

本研究發現，施肥處理顯著促進脲酶活性，這與宋學貴等（2009）和涂利華等（2009）在不同森林生態系統中的研究結論相類似。N和NP添加對脲酶活性影響較大，N添加下脲酶活性增加，而在NP共同添加下其活性則進一步顯著增加。從相關性分析結果可知，脲酶活性與pH、銨態氮、硝態氮、葡萄糖苷酶呈極顯著負相關。脲酶主要來自植物根系的分泌物，而氮添加促進了植株根系的生長，導致根系分泌物增加，增強脲酶活性。本研究中施肥處理中P添加下脲酶活性最高，表明P添加使土壤銨態氮含量和葡萄糖苷酶活性降低導致有機氮的礦化速率升高，從而使土壤微生物群落對土壤脲酶的分泌增加，其活性也隨之增高，與Zi et al.（2022）在 P添加下脲酶活性增高結果一致。馮慧芳等（2022）對 5種不同密度大葉相思（Acacia auriculiformisA.Cunn.ex Benth.）研究結果有不同結論，N和NP添加對脲酶活性均有顯著抑制現象，P添加對高密度林分脲酶活性有顯著促進作用，這可能與N添加量植被類型、N添加時間長短不同有關。

土壤酶主要來自于土壤微生物的釋放，還包括植物根系分泌物以及土壤動植物殘體腐解過程的釋放（Yang et al.，2017）。本研究中，各施肥處理對蔗糖酶、葡萄糖苷酶和脲酶活性均表現出顯著促進作用（圖3a—c），這與Xiao et al.（2021）的施氮試驗結果一致，施氮顯著提高轉化酶活性，NP添加通過改變表層土壤養分條件，改變植物對養分的吸收利用，影響高寒草地土壤有機層細菌的生長活力和營養有效性，使植物、微生物群落結構及數量發生變化，進而不同程度提高有關碳氮獲取酶的含量。

4 結論

本研究中施肥處理相比于對照處理顯著改變了高寒草地土壤養分和酶活性條件，降低了土壤pH。氮和氮相關（NP添加）添加對碳含量有顯著的促進作用，主要表現為N添加后顯著促進土壤有機碳含量，并增加蔗糖酶和葡萄糖苷酶活性，水解更多大分子含碳有機物供植物吸收利用。N添加和P添加顯著促進土壤氮含量，N添加顯著促進土壤氮元素含量，增幅較大，P添加促進土壤脲酶活性，水解含氮物質，給植物提供養分。然而，NP添加下氮元素并沒有促進跡象，具體表現為氮素含量較單獨的 N和P添加下顯著降低。本研究未對磷相關酶和地上地下生物量進行研究，今后應進一步研究。