甘草堿溶性多糖超聲提取工藝的均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選

唐世明

（和田師范專科學(xué)校,新疆 和田 848000）

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）為豆科甘草屬多年生草本植物，味甜，能夠清熱解毒，極具藥用價(jià)值[1]。尤其是甘草堿溶性多糖具有提高免疫力、抗病毒等功效，是甘草資源開發(fā)和利用的重點(diǎn)。

研究表明，超聲提取法具有流程簡單、節(jié)約成本的優(yōu)點(diǎn)[2-3]，而當(dāng)前使用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選甘草堿溶性多糖提取工藝的報(bào)道較少。本文以甘草堿溶性多糖提取率為指標(biāo)，分析NaOH濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等對多糖提取率的影響，通過U*6（64）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化超聲法的提取工藝條件，為甘草的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試材和試劑

甘草購買于和田市欣明維吾爾醫(yī)藥材交易市場，烘干粉碎。

試驗(yàn)試劑包括石油醚（A.R）、無水乙醇（A.R）、正丁醇（A.R）、三氯甲烷（A.R）、丙酮（A.R）、濃硫酸（A.R）、苯酚（A.R）、NaOH（A.R）、葡萄糖（A.R）。

1.2 儀器與設(shè)備

可見分光光度計(jì)722S（上海精密科學(xué)儀器有限公司制造），臺(tái)式離心機(jī)TDL-40B9（上海安亭科學(xué)儀器廠制造），數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-Z（國華電器有限公司），RE-6000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器設(shè)備有限公司），超聲波清洗儀KQ-250DB（昆山市超聲波儀器有限責(zé)任公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 超聲提取法

對甘草進(jìn)行清洗、烘干、粉碎處理。稱取30 g甘草粉末置于圓底燒瓶中，加入180 mL石油醚，放入60～90 ℃水浴鍋中脫脂2 h。舍棄脫脂液，用180 mL80%乙醇浸泡殘?jiān)? h，之后80 ℃水浴加熱1 h，過濾。稱取脫脂后甘草粉末若干份（0.5g/份），分別在選定的NaOH濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、250W的超聲功率下使用超聲波儀器進(jìn)行超聲，提取一次，將提取液2 000 rpm離心5 min，取上清，加入0.1%活性炭，60 ℃水浴鍋脫色20 min，再2 000 rpm離心5 min。取上清，加入1.5倍體積的氯仿-正丁醇搖勻，靜置25 min后吸取上清液，加入95%乙醇靜置12 h，然后2 000 rpm離心5 min。去上清，沉淀依次用無水乙醇、丙酮多次洗滌，60 ℃干燥至恒重。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL、2.1 mL置于標(biāo)有A、B、C、D、E、F、G、H號(hào)的干燥試管中并分別加水至3.0 mL，再分別加入6%苯酚溶液0.8 mL及濃硫酸4.8 mL，靜置10 min，充分搖勻，室溫下再放置20 min。同時(shí)以蒸餾水作為空白對照，在490 nm處測定每個(gè)試管中溶液的吸光度A值。以濃度（c）為橫坐標(biāo)（X），吸光度A值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]，得到A=0.012 2c-0.067 3，R2=0.997。

2.3 甘草堿溶性多糖含量的測定

精確量取1 mg甘草堿溶性多糖粉末于50 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻；精確量取1 mL此稀釋液于10 mL的容量瓶中，加水至刻度線定容，搖勻。最終將提取液稀釋500倍。精確量取2 mL稀釋后的溶液于試管中，滴加6%苯酚溶液1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，充分搖勻，室溫下再靜置20 min后在490 nm處測定吸光度A值。利用回歸方程求甘草堿溶性多糖含量。

2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

控制單一變量分別研究NaOH濃度（20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、提取時(shí)間（15 min、20 min、25 min、30 min）、提取溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）四個(gè)因素對甘草堿溶性多糖提取率的影響（見表1）。

2.5 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇U*6（64）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)表研究Na0H濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素的相互影響，各因素水平情況和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案見表2。

表2 U*6（64）設(shè)計(jì)方案

3 結(jié)果

單因素試驗(yàn)中，按照表1中各因素水平，在料液比為1:20（vol），45℃下超聲提取25min，測得NaOH濃度為40mg/mL時(shí)甘草堿溶性多糖的提取率最高。在 NaOH溶液為40 mg/mL，45℃下超聲提取25min，測得甘草堿溶性多糖的提取率在料液比為達(dá)到1 ∶20（vol）時(shí)最高。在料液比為1:20（vol），NaOH溶液為40 mg/mL，45℃下超聲提取，測得甘草堿溶性多糖的提取率在提取時(shí)間為25min時(shí)最高。在料液比為1 ∶20（vol），NaOH溶液為40 mg/mL下超聲提取25min，測得甘草堿溶性多糖的提取率在提取溫度為45℃時(shí)最高。因此甘草堿溶性多糖的最佳提取條件為：NaOH濃度為40mg/mL，料液比達(dá)到1:20（vol），提取時(shí)間為25min，提取溫度為45℃。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平

按照U*6（64）使用表（如表2）進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果見表3。其中以第3號(hào)試驗(yàn)所得提取率最高，為48.45%。

表3 U★6（64）試驗(yàn)表及結(jié)果

即當(dāng)Na0H濃度取3號(hào)因素水平22.5 mg/mL，料液比取6號(hào)因素水平1 ∶35，提取時(shí)間為2號(hào)因素水平25 min，

提取溫度為4號(hào)因素水平45 ℃時(shí)，四種因素相互作用對多糖提取率影響最大。求得回歸方程為Y=87.04-0.24X1-903.00X2-0.16X4，回歸方程、偏回歸系數(shù)經(jīng)檢驗(yàn)均不顯著，說明回歸方程不可信。

考慮四個(gè)因素的二階以及所有的交互作用重新設(shè)計(jì)，選用U*17（178）使用表（見表4）進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果過見表5。其中以第6號(hào)試驗(yàn)所得多糖提取率最高，即當(dāng)Na0H濃度取6號(hào)因素水平30 mg/mL，料液比取9號(hào)因素水平1 ∶25，提取時(shí)間為16號(hào)因素水平45 min，提取溫度為5號(hào)因素水平30℃時(shí)，四種因素相互作用對多糖提取率影響最大。用線性回歸模型擬合數(shù)據(jù)，求得回歸方程為Y=70.72-896.13X2，回歸方程、偏回歸系數(shù)經(jīng)檢驗(yàn)顯著，說明回歸方程可信。因此，其工藝條件為Na0H濃度為30 mg/mL，料液比為1 ∶25，提取時(shí)間為45 min，提取溫度為30℃。

表4 U*17（178）各因素水平

表5 U*17（178）試驗(yàn)表及結(jié)果

4 討論與結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定了甘草堿溶性多糖的最佳提取條件為：NaOH濃度為40mg/mL，料液比達(dá)到1 ∶20（vol），提取時(shí)間為25min，提取溫度為45℃。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用U*6（64）均勻設(shè)計(jì)法對四個(gè)提取條件進(jìn)一步篩選，其最佳工藝條件為Na0H濃度為22.5 mg/mL，料液比為1 ∶35，提取時(shí)間為25 min，提取溫度為45 ℃，用線性回歸模型擬合數(shù)據(jù)，求得回歸方程為Y=87.04-0.24X1-903.00X2-0.16X4，回歸方程、偏回歸系數(shù)經(jīng)檢驗(yàn)均不顯著，說明回歸方程不可信。重新采用U*17（178）均勻設(shè)計(jì)法對四個(gè)提取條件重新篩選，其最佳工藝條件為Na0H濃度為30mg/mL，料液比為1 ∶25，提取時(shí)間為45 min，提取溫度為30℃。獲得線性回歸方程Y=70.72-896.13X2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方程顯著。因此，最終通過均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化草堿溶性多糖的最佳提取條件為Na0H濃度為30 mg/mL，料液比為1 ∶25，提取時(shí)間為45 min，提取溫度為30℃。同時(shí)也說明回歸方程并非真正的最終模型，而是在線性框架下的產(chǎn)物。