基于網絡藥理學探討桂枝茯苓丸治療子宮內膜異位癥的作用機制

閆菲 史云 趙琦 王曉梅 高煥鵬 徐可 王亦姝 韓福國 劉清飛

摘要 目的：運用網絡藥理學研究方法探討中醫經典名方桂枝茯苓丸治療子宮內膜異位癥（EMS）的作用機制。方法：在TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID中篩選桂枝茯苓丸的成分和靶點;并通過OMIM、GeneCards數據庫檢索EMS相關靶點;取交集后得到桂枝茯苓丸和子宮內膜異位癥的共同靶點，利用Cytoscape 3.6.1構建化合物-靶點-疾病作用圖;使用STRING網站完成蛋白質-蛋白質相互作用分析，通過David數據庫完成基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果：共篩選出桂枝茯苓丸82個成分和962個預測靶點，子宮內膜異位癥靶點1 158個;通過比對桂枝茯苓丸和EMS共同靶點，篩選出246個潛在基因;這些共同靶點涉及對化學物質反應、分子功能調節、信號受體結合等生物過程;生物學通路包括TNF、PI3K/AKT和MAPK信號通路等。結論：桂枝茯苓丸可能通過抑制血管生成、抗炎等途徑對EMS產生治療作用。

關鍵詞 網絡藥理學;桂枝茯苓丸;子宮內膜異位癥;成分-靶點-疾病

Abstract Objective：To explore the mechanism of action of Guizhi Fuling Pills，a classic traditional Chinese medicine，in the treatment of endometriosis（EMS） by using the method of network pharmacology.Methods：TCMSP，BATMAN-TCM and TCMID were used to obtain the components，and EMS targets of GP were predicted by OMIM and Gene Cards and literature review.Cytoscape 3.6.1 software was used to construct the “component-target-disease” network.The STRING website was used for the analysis of protein-to-protein interaction（PPI） data.DAVID 6.8 was used to carry on GO analysis and KEGG pathway analysis.Results：A total of 82 active ingredients and 962 potential targets of GP were obtained from TCMSP，BATMAN and TCM-ID，1158 EMS related targets were retrieved from the disease database.Then 246 common targets were obtained.Biological processes were related to reaction to chemicals，molecular function regulation，signal receptor binding，etc.The biological pathways mainly included TNF，PI3K/AKT，and MAPK signaling pathways.Conclusion：Guizhi Fuling Pills may treat endometriosis by inhibiting angiogenesis，anti-inflammatory and other biological pathways.

Keywords Network Pharmacology; Guizhi Fuling Pills; Endometriosis; Component-target-disease

中圖分類號：R285文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.010

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMS）定義為子宮內膜組織（腺體和間質）在子宮腔被覆內膜及子宮之外部位出現、生長、浸潤、反復出血的一類多發于育齡期女性的常見疾病，表現為繼發性痛經、月經紊亂、卵巢子宮內膜異位囊腫、不孕等癥狀[1]。由于人群樣本和診斷方法存在差異，EMS的患病率不盡相同，據統計，在育齡期女性中患病率為10%～15%，其中36%～87%異位病灶位于卵巢，不孕率更是高達40%[2-3]。目前，有關EMS病因尚未闡明，現有手段主要包括藥物、手術和輔助生殖等治療方式。口服激素類藥物可以改善患者臨床癥狀，減低病灶活性，但不良反應多，停藥后易復發;手術治療可切除病灶，恢復盆腔解剖結構，但手術禁忌證多，適應人群范圍窄;輔助生殖主要針對有生育要求但不具備自然受孕條件的患者群體。有臨床研究顯示，無論采用何種治療方法，大約50%EMS患者的癥狀將會在5年內復發[4]。因此，尋找更有效的治療EMS的措施以盡可能延緩病情和減少復發成為了婦科學研究領域重要的臨床問題。

中醫多根據EMS臨床表現，將其歸屬于“痛經”“癥瘕”等范疇，該病以血瘀為主要病因病機，同時兼夾腎虛、氣滯、寒凝、氣虛等次要病因病機[5]。桂枝茯苓丸是仲景《金匱要略》中的經典方劑，主治婦女宿有癥塊、妊娠胎動、漏下不止及瘀血所致的痛經、癥瘕痞塊等癥，現代臨床多用于子宮內膜異位癥、子宮肌瘤等的治療，臨床療效顯著[6-7]。臨床研究證明桂枝茯苓丸能有效改善EMS患者盆腔疼痛癥狀，對盆腔包塊及觸痛結節等體征有明顯改善作用[8-9];相關動物實驗表明，桂枝茯苓丸對EMS大鼠性激素水平、血管生成、免疫功能均具有調節作用[10-11]。然而，有關桂枝茯苓丸治療EMS的機制研究多僅為單一通路、單一機制研究，對其治療EMS的主要組成成分和作用機制未能進行系統闡釋。近年來，網絡藥理學憑借其能夠系統整合藥物“多成分-多靶點-多通路”的研究特征，能夠很好結合藥理機制、高通量測序和拓撲網絡分析等，從而能全方位、多角度、全面化展示中藥藥理學作用的研究性質，成為研究中藥藥理的新興學科[12-13]。因此，本研究將運用網絡藥理學方法探索桂枝茯苓丸治療EMS的核心化學成分和內在藥理作用，全面揭示其內在機制。

1 資料與方法

1.1 桂枝茯苓丸潛在化學成分及作用靶點篩選 桂枝茯苓丸內5種中藥的化學成分將從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中藥分子機制生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）、中藥分子機制綜合數據庫（TCMID）中進行檢索。一般認為，口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18是化合物能否進入體內起效的核心指標。根據檢索條件，將以上數據庫預測成分合并，建立桂枝茯苓丸化合物-靶點數據集。

1.2 EMS疾病靶點篩選 EMS相關作用靶點將在在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//www.omim.org/）和人類基因數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org）中檢索，檢索關鍵詞為“Endometriosis”，刪除重復后合并數據集。將桂枝茯苓丸化合物對應靶點和EMS相關靶點取交集后，可得到桂枝茯苓丸和EMS共同靶點，并構建桂枝茯苓丸成分靶點-EMS疾病靶標映射關系，運用Cytoscape 3.6.1軟件構建“成分-共同靶點”圖，成分和靶點用“節點”表示，節點之間關系用“邊”表示。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 將共同靶點上傳至STRING（https：//string-db.org/）在線數據庫中，選擇置信度分數score≥0.700（高置信度）為條件進行篩選，將無關聯的節點進行隱藏，其他參數不變，得到共同靶點蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡圖，并在Cytoscape軟件中進行可視化展示。

1.4 基因本體和京都基因與基因組百科全書富集分析 David在線數據庫是研究蛋白質功能的重要數據庫，能夠為多種基因及蛋白質提供功能注釋信息。我們將共同靶點上傳至David數據庫進行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析。GO分析能夠注釋基因功能，主要包括分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cell Component，CC）和生物過程（Biological Process，BP）3種方式。KEGG分析主要根據最小二乘法計算得到目的蛋白在有關通路的富集結果。使用氣泡圖對GO和KEGG功能富集分析結果進行可視化展示。

2 結果

2.1 桂枝茯苓丸化學成分與作用靶點篩選 通過對TCMSP、BATMAN、TCMID數據庫進行篩選，并結合文獻篩選，最終得到桂枝茯苓丸潛在活性化合物82個，包括桂枝5個，茯苓18個，桃仁24個，赤芍31個，牡丹皮13個，共預測潛在靶點962個。

2.2 EMS潛在疾病靶點篩選 從OMIM、GeneCards疾病數據庫檢索EMS相關靶點，合并后得到EMS靶標1 158個。將化合物靶點和疾病靶標取交集后，最終獲得AKT1、IL6、MMP9、VEGFR、MAPK8、TNF等246個潛在核心靶標。

2.3 “化合物-共同靶點”網絡構建 將共同靶點及相關桂枝茯苓丸化合物相關關系導入Cytoscape，建立“成分-靶點-疾病”網絡。見圖1。用Degree表示網絡中節點的中心性，Degree越高表示節點在網絡中越重要。在本網絡中，Quercetin（槲皮素）Degree為87，Kaempferol（山柰酚）為34，Baicalein（黃芩苷）為20，Beta-sitosterol（β-谷甾醇）為19，Dehydroeburicoic acid（去氫齒孔酸）為18，位于前5位。見表1。

2.4 PPI網絡的構建 上傳共同靶點至STRING在線平臺，獲得靶點之間的相互作用關系，并下載PPI.tsv，導入Cytoscape進行PPI展示。圖中越靠近圓形中心Degree值越高，因此AKT1、TP53、EGF、VEGFR、IL6、TNF位于核心基因位置。見圖2～3。

2.5 桂枝茯苓丸-EMS-基因的GO富集分析 GO富集分析結果顯示桂枝茯苓丸-EMS-基因的BP顯著富集在對含氧化合物的反應、對有機物質的反應、細胞對化學刺激的反應、細胞對有機化合物刺激的反應、對化學物質的反應;MF主要富集在信號受體結合、受體調節活性、受體配體活性、分子功能調節劑、酶結合上;CC主要富集在細胞外空間、細胞外區域、膜筏、膜微區、膜區域上。見圖4～6。

2.6 桂枝茯苓丸-EMS-靶點KEGG分析 KEGG分析獲得相關核心通路62條，通過查閱文獻排除明確不相關富集結果，同時結合文獻進行篩選，按P值排序挑選出重要性前20條信號通路使用氣泡圖展示。KEGG富集結果包括TNF、PI3K/AKT、Toll樣受體、MAPK信號通路和凋亡相關信號通路等。見圖7～8。富集前10位細節見表2。

3 討論

3.1 桂枝茯苓丸組方分析 EMS是現代西醫學病名，中醫古籍中將其歸屬為“痛經”“癥瘕”“不孕癥”等范疇。現代醫家對本病理解雖略有不同，但總以血瘀為核心病因病機。桂枝茯苓丸出自《金匱要略》婦人病篇，原方主治婦人素有癥疾，而致妊娠胎動不安或漏下不止之癥。全方共由5味中藥組成，其中桂枝辛甘而溫為君藥，溫通血脈行瘀滯，臣以桃仁活血化瘀破血結，加入一味牡丹皮，涼血祛瘀同時可清退瘀久所化之熱，芍藥緩急止痛以對癥治療，同時可柔肝理脾調氣血，佐以茯苓淡滲下行利水濕，健脾益胃，以助消癥之功，丸以蜂蜜。全方寒溫并用，有活血化瘀、緩消癥塊之功用，對于瘀血阻滯胞宮之類病證，如子宮內膜異位癥、痛經、子宮肌瘤等臨床療效顯著[14]。

3.2 桂枝茯苓丸活性成分分析 通過分析得到桂枝茯苓丸治療EMS的活性成分82個，包括槲皮素、山柰酚、黃芩苷、β-谷甾醇、二氫齒孔酸、茯苓酸、柳杉酚、藿香黃酮醇、鞣花酸、茯苓酸B等。槲皮素、山柰酚是主要的類黃酮醇類的功能性物質，有一定的抗炎、抑制血管增生的功效。有研究發現，槲皮素不僅可以誘導EMS模型大鼠的異位內膜萎縮[15-16]，還可以抑制異位癥細胞End1/E6E7的增殖并誘導細胞周期阻滯，通過DNA斷裂、線粒體膜電位損失和活性氧產生而促進細胞凋亡[17]。黃芩苷可以呈劑量依賴性地降低人體異位子宮內膜基質細胞的體外成活，并對細胞周期產生調控作用[18]。鞣花酸可以對體外子宮內膜間質細胞黏附、遷移和細胞周期均產生抑制作用。因此我們認為以上化合物是桂枝茯苓丸治療EMS的重要活性成分[19]。

3.3 關鍵靶點分析 PPI分析得到前10位核心靶點包括VEGFA、IL6、MMP9、AKT1、MAPK8、PTGS2、INS、TNF。血管生成是EMS發病的關鍵步驟，新生血管的形成在EMS病變的形成和進展中具有基礎性作用[20]。VEGFA是血管內皮生長因子VEGF家族的組成蛋白，在機體內復雜血管系統形成和血管穩態調控中具有關鍵作用。有臨床研究表明，EMS患者腹腔液和異位病灶中的VEGFA水平顯著高于正常組[21]。相關實驗發現，使用高效孕激素——目前用于ENS治療的一線藥物，對腹腔移植有子宮內膜細胞的裸鼠進行干預后，異位組織VEGFA水平明顯下降，病灶中微血管密度也顯著下降[22]。EMS是一種具有免疫相關的慢性炎癥性疾病，子宮內膜中的炎癥環境和異常免疫應答被認為在內膜病變的發生和進展中起到重要作用，尤其是子宮內膜細胞與巨噬細胞之間的分子交流，免疫反應調節因子IL-6就被認為是其中重要的炎癥介質[23-25]。EMS患者原代子宮內膜細胞的體外培養中的炎癥介質分泌濃度顯著高于非EMS患者，其中IL-6的表達含量更是與培養體系中的細胞數量強相關[26]。基質金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）是細胞外基質合成和降解調節中的2個重要因子，其中又以MMP-9及其抑制劑TIMP-1最為重要，正常生理條件下二者以一定比例存在于子宮內膜組織中，而相關臨床報道發現，EMS患者異位子宮內膜里MMP/TIMP系統處于失衡狀態，失衡程度與疾病進展及分期密切相關[27]。在EMS大鼠模型中也可以發現，相對于正常子宮內膜，異位內膜病灶表現出更強的細胞分化、增殖及組織侵襲能力，進行免疫熒光檢測證實病灶中的MMP-9、TIMP-1的熒光強度也顯著高于正常子宮內膜[28]。

3.4 核心信號通路分析 通過查閱文獻，發現KEGG富集結果中TNF、PI3K/AKT、Toll樣受體、MAPK信號通路和凋亡相關信號通路等與EMS密切相關。EMS是一類復雜的免疫炎癥性疾病，越來越多的研究證明，EMS相關性不孕與盆腔的炎癥微環境導致的卵巢排卵失常密切相關，而TNF信號通路是核心炎癥信號通路。有臨床研究發現，ENS相關性不孕患者與非EMS相關性不孕患者比較，腹腔液中的TNF-α及其他炎癥介質顯著升高[29-30]。運用全基因組技術對EMS模型大鼠及正常對照組的卵巢對比分析，發現腹膜液中的TNF-α可以通過影響卵巢早期生長因子EGR1的表達而影響排卵，繼而導致不孕[31]。PI3K/AKT信號通路是體內重要通路，能夠調節多種生物過程如凋亡、增殖、自噬、血管生成、代謝等[32]。相關研究證明，PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達與EMS的進展分期、相關坐骨神經痛密切相關[33-34]，改變PI3K/AKT通路可以對子宮內膜間質細胞的上皮細胞-間充質轉化（EMT）、子宮內膜細胞ESC的增殖和侵襲過程產生重要影響[35-36]。某些相關單體如蘿卜硫素、人參皂苷Rg3的使用，更是可以通過調控PI3K/AKT信號通路誘導異位內膜細胞的凋亡、抑制病灶擴長、粘連和血管生成，進而減緩病程進展[37-38]。EMS作為一類激素依賴性的慢性炎癥性疾病，子宮內膜細胞向腹膜表面的遷移過程可受到雌激素、各類生長因子及細胞內信號級聯反應通路的快速激活，被認為是腹膜型及卵巢EMS發生的關鍵[39]。MAPK信號通路可以被多種類固醇激素和生長因子激活，在基因表達、細胞增殖、凋亡、惡變及浸潤轉移中起到重要作用，由于其在性激素及炎癥之間的特殊調節作用，使其在EMS病變研究中越來越重要[40-41]。相關研究發現，雌二醇（E2）可以激活MAPK信號通路，使得EMS患者腹膜液中某些趨化蛋白如CCL2（一種具有趨化作用并激活單核細胞核巨噬細胞的特異性因子）的生成明顯高于正常組，進而影響異位細胞的成活、增殖及侵襲功能，繼而影響EMS的發病進展[42]。此外，MAPK信號通路還參與了EMS相關性盆腔痛，在疼痛的敏感性中起到重要作用[43]。

綜上所述，桂枝茯苓丸治療EMS的內在作用機制可能與血管生成、炎癥反應和細胞信號轉導等途徑相關。本研究運用網絡藥理學方法，從多層面、多角度對桂枝茯苓丸治療EMS內在機制進行了初步探索，今后還需借助動物與細胞實驗對桂枝茯苓丸治療EMS的化學成分和內在機制進行深入研究，為臨床應用提供更重要的證據支持。

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（2020-08-23收稿 本文編輯：魏慶雙）