紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵飲料的工藝

尹蓉，張倩茹，茹建生，王賢萍，梁志宏*

山西農業大學果樹研究所，果樹種質創制與利用山西省重點實驗室（太原 030031）

乳酸菌（Lactobacillus）是一種能夠將碳水化合物發酵成乳酸的益生菌[1-2]。已知的乳酸菌至少可分為乳桿菌屬（Lactobacillus）、連球菌屬（Streptococeus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等18個屬，目前實際應用的有德氏乳桿菌（L.delbrueckii）、保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）、嗜酸乳桿菌（L.acidophlus）、干酪乳桿菌（L.casei）、瑞士乳桿菌（L.helviticus）等[3-5]。乳酸菌發酵后的水果飲料中新產生的乳酸可增加柔和的口感，并具備益生活菌，其代謝產物具抗衰老、降低膽固醇、調節血脂、增強免疫力、抑制腫瘤、改善胃腸菌群等保健功效[5-6]。王玥等[7]利用柿子汁發酵乳酸菌飲料，通過穩定性、口感和產品質量的分析，篩選出的優勢發酵菌種為植物乳桿菌，得到的最佳工藝參數為發酵溫度33 ℃、菌種接種量4%、發酵時間14 h。高玉榮等[8]以嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）發酵巨峰葡萄汁，通過單因素正交優化試驗，得出初始pH、接種量、發酵溫度和發酵時間對嗜酸乳桿菌活菌數和感官品質影響顯著，最佳工藝條件為初始pH 4.5、接種量2.5%、發酵溫度32 ℃、發酵時間26 h。此外，韋金娜等[9]對殺菌型百香果味乳酸菌飲料、劉秋豆等[10]對芒果汁乳酸菌發酵飲料、黃天等[11]對山藥益生菌飲料的發酵工藝進行了研究。

紅樹莓（Rubus idaeusL.）和山楂（Crataegus pinnatifidaL.）均含有豐富的營養和功能性成分，具有良好的食用價值和藥用價值[12-14]。將二者按一定比例混合制作成乳酸菌發酵飲品，將更好地提升功能性和商品性。對紅樹莓和山楂復合果汁的乳酸菌發酵工藝進行單因素試驗和正交優化試驗，得出最佳工藝參數，豐富乳酸菌發酵工藝的實踐經驗，并為紅樹莓和山楂的利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮紅樹莓、山楂，產自山西農業大學果樹研究所；葡萄糖、小蘇打粉、果葡糖漿，均為食品級。

ME204型電子分析天平[基睿電子科技（上海）有限公司]；JYZ-V18A渣汁分離榨汁機（九陽股份有限公司）；XZS-450過濾器（新鄉市先鋒振動機械有限公司）；101-0A電熱鼓風干燥箱（天津市通利信達儀器廠）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；Sartorius PB-10酸度計[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 飲料制作步驟

1) 選取新鮮、無病蟲害的紅樹莓、山楂果清洗并晾干。

2) 將紅樹莓果直接用渣汁分離榨汁機打汁，進行稀釋；山楂果加純凈水后打汁，分別留取汁液進行過濾，備用。

3) 將制備好的紅樹莓、山楂汁稀釋汁以一定的比例混合，加入10%的葡萄糖。

4) 將上述混合果汁在80 ℃水浴鍋中滅菌20 min，取出后晾涼。

5) 加入直投式植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌干粉（質量比為4∶3∶3），在37 ℃烘箱中恒溫發酵；

6) 加入10%果葡糖漿進行調配。

1.2.2 單因素試驗

固定其他因素，以pH、活菌數、感官評分作為評價指標，分別考察發酵時間、果汁稀釋倍數、乳酸菌接種濃度和紅樹莓汁/山楂汁體積比對乳酸菌發酵果汁品質的影響。

1.2.3 正交優化試驗

根據單因素試驗結果，對發酵時間、果汁稀釋倍數、乳酸菌接種濃度和紅樹莓汁/山楂汁體積比進行L9(43)正交試驗，以活菌數和感官評分作為考核指標，進行極差分析和方差分析。

1.2.4 感官評價方法

參照GB/T 21732—2008《含乳飲料》[15]和T/LYFYA 004—2019《乳酸菌飲料》[16]，從色澤、口感、香氣、澄清度等方面制定紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵飲料評價標準[17-18]，請10位專業人員分別對飲料進行感官評定，總分為100分，評分標準見表1。

表1 紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵飲料感官評分標準

1.2.5 數據處理

采用Excel、SPSS 16.0軟件進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵時間的確定

乳酸菌發酵需要一定的時間。時間過短，發酵不完全；時間過長，又會形成過多的酸性物質，影響果汁的風味。因此，確定合適的發酵時間是制作乳酸菌果汁飲品的必需步驟。將制成的果汁按照1∶1的比例混合，稀釋3倍，添加1%的復合乳桿菌，在37 ℃下進行恒溫發酵，不同發酵時間下pH和活菌數如圖1所示。

由圖1可知：發酵果汁的pH隨著發酵時間的延長呈現先降低后穩定的趨勢，穩定開始的時間點為發酵48 h，這是因為隨著發酵中乳酸菌不斷地將果汁中的可酵糖轉化為乳酸，酸性物質越來越多，直到可酵糖全部利用完，酸性物質含量不再變化，使得果汁的pH變得穩定。活菌數隨著發酵時間的延長先升高，到發酵48 h后不再有明顯變化，這說明發酵48 h后活菌數趨于穩定。

圖1 發酵時間對紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵飲料pH和活菌數的影響

2.1.2 果汁稀釋倍數的確定

紅樹莓和山楂酸度高，必須添加大量食用小蘇打才能有效降低樹莓汁和山楂汁酸度，但過多的小蘇打嚴重影響果汁色澤和風味，因此需進行稀釋后再發酵。將制成的果汁按照1∶1的比例混合，稀釋成不同的濃度，添加1%的復合乳桿菌，在37 ℃下進行恒溫發酵48 h，pH和活菌數如圖1所示。

圖2顯示：在發酵溫度、發酵時間和接種量固定的情況下，隨著紅樹莓山楂果汁稀釋倍數的增加，乳酸菌發酵果汁的pH呈現先下降后趨于平緩的趨勢，活菌數隨著稀釋倍數的增加先升高后趨于平緩，因為較高濃度的果汁酸度高，影響乳酸菌的活性，稀釋倍數變大后，果汁酸度越來越適合乳酸菌增殖代謝，而稀釋倍數達到4后，pH變化不大，表明果汁酸度小，不會制約乳酸菌活性。考慮到果汁濃度越低，乳酸菌發酵果汁的風味會越淡，因此稀釋4倍是果汁濃度的合適選擇。

圖2 果汁稀釋倍數對紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵飲料pH和活菌數的影響

2.1.3 乳酸菌接種量的確定

過少的乳酸菌在酸性果汁中不足以啟動發酵動能，但過多乳酸菌因價格高，會增加發酵飲料的成本，因此需要確定乳酸菌的接種量。取4倍體積稀釋的1∶1混合果汁，添加不同量的混合乳酸菌發酵干粉，在37 ℃下進行恒溫發酵48 h，pH和活菌數如圖3所示。

圖3 乳酸菌接種量對紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵飲料PH和活菌數的影響

由圖3可知：在同樣的發酵溫度和發酵時間下，隨著乳酸菌接種量的增加，乳酸菌發酵果汁的pH呈現先下降后趨于平緩的趨勢，活菌數隨著稀釋倍數的增加先升高后趨于平緩，二者均是在乳酸菌接種量為1%時達到一個穩定值，說明此時乳酸菌的量與底物濃度比例最為合適，超過1%對乳酸菌的增殖無明顯影響。另外，發酵劑濃度過低，產酸速率慢，會拉長發酵時間，而發酵劑濃度過高，會極大提高產酸速率，研究表明產酸速率過快會使發酵液的風味變差。因此，選擇乳酸菌接種量1%為最適宜濃度。

2.1.4 紅樹莓汁和山楂汁體積比的確定

紅樹莓汁和山楂汁體積比對最終風味的形成有影響，在上述試驗確定的發酵時間48 h、稀釋倍數4倍和乳酸菌接種濃度1%的條件下發酵，制作好的紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵果汁經10位專業人士感官評價，依照表1打分，去掉最高分和最低分，結果見表2。

由表2可知，山楂汁比例大的復合乳酸菌發酵果汁整體比紅樹莓汁比例大的感官評分高，在紅樹莓汁占比大的果汁中，紅樹莓汁比例越高評分越低。評分最高的為紅樹莓汁與山楂汁體積比1∶3的發酵果汁，其次為2∶3和1∶1的發酵果汁。

表2 不同紅樹莓汁和山楂汁體積比所得乳酸菌發酵果汁的感官評分

2.2 正交優化試驗

以發酵時間、稀釋倍數、乳酸菌接種濃度和紅樹莓汁/山楂汁體積比為考察因子，進行四因素三水平試驗（表3），研究其在紅樹莓山楂復合乳酸菌發酵果汁中的互作影響。試驗設計及結果見表3和表4，方差分析結果見表5。

表3 正交優化試驗設計

由表4可知：根據極差值R的大小，影響紅樹莓山楂復合乳酸發酵果汁活菌數的主次因素順序為乳酸菌接種濃度＞果汁稀釋倍數＞發酵時間＞紅樹莓汁與山楂汁體積比，而影響感官評分的主次因素順序為紅樹莓汁與山楂汁體積比＞乳酸菌接種濃度＞果汁稀釋倍數＞發酵時間，最佳工藝條件為發酵時間60 h、果汁稀釋倍數3倍、乳酸菌接種濃度1%、紅樹莓汁與山楂汁體積比2∶3。在此條件下進行3次平行驗證試驗，得到活菌數的均值為7.56、感官評分均值為87.8的發酵果汁。

表4 正交優化試驗設計及結果

根據方差分析結果（表5）：果汁稀釋倍數、乳酸菌接種濃度對紅樹莓山楂復合乳酸發酵果汁活菌數存在極顯著影響，而發酵時間對活菌數存在顯著影響，其影響力大小順序為乳酸菌接種濃度＞果汁稀釋倍數＞發酵時間＞紅樹莓汁與山楂汁體積比，與極差分析結果一致；紅樹莓汁與山楂汁體積比、乳酸菌接種濃度對發酵果汁感官評分分別存在極顯著和顯著影響，4個因素的影響力大小順序為紅樹莓汁與山楂汁體積比＞乳酸菌接種濃度＞發酵時間＞果汁稀釋倍數，與極差分析結果略有不同，發酵時間、果汁稀釋倍數影響力在二者中正好相反。鑒于方差分析能夠準確估算誤差，檢測精度更高，因此以方差分析結果為準。

表5 正交試驗結果方差分析

3 討論與結論

紅樹莓、山楂復合果汁可以在稀釋且無需調pH的情況下，經混合乳酸菌發酵，制作成風味較佳的乳酸菌飲料。對比之前諸多的研究，因采用原汁發酵，都需添加碳酸鹽或鹽酸調節初始pH，大大降低了發酵飲料的感官品質。而此次研究雖將紅樹莓、山楂汁進行了稀釋，但仍能較好地保持色澤和風味，且與乳酸發酵物形成較好的契合，另外科學的配比也使最終的感官品質提高，是值得提倡的乳酸發酵飲料。

通過單因素試驗和正交試驗可知，果汁稀釋倍數、乳酸菌接種濃度和發酵時間對紅樹莓山楂復合乳酸發酵果汁活菌數存在極顯著或顯著影響，紅樹莓汁與山楂汁體積比、乳酸菌接種濃度對發酵果汁感官評分分別存在極顯著和顯著影響，并得到最佳工藝參數：發酵時間60 h、果汁稀釋倍數3倍、乳酸菌接種濃度1%、紅樹莓汁與山楂汁體積比2∶3。在此工藝參數下，得到活菌數均值為7.56、感官評分均值為87.8的乳酸菌發酵果汁。