利用細(xì)胞壁降解酶混合物增強(qiáng)亞麻籽油的提取

李國(guó)斌

華寶香精股份有限公司上海分公司（上海 201821）

亞麻（Linumusitatissimum），屬亞麻科（Linaceae）亞麻屬（Linum）1年生草本植物，其內(nèi)部含有35%～ 45%的油，亞麻籽油在烹飪、制藥、化妝品和醫(yī)學(xué)方面受到歡迎，主要是因?yàn)槠浜懈咚降牟伙柡椭舅幔从退岷蛠営退幔€有將亞麻籽油轉(zhuǎn)化成其他有價(jià)值的產(chǎn)品如生物燃料的應(yīng)用前景[1]。

亞麻籽油傳統(tǒng)上是通過液壓擠壓和溶劑提取獲得，主要是用正己烷作為溶劑，利用機(jī)械方法或加熱方法能夠顯著提高該過程的產(chǎn)率[2]。種子的碾磨大幅提高效率，因?yàn)檫@一操作破壞植物細(xì)胞，增加傳質(zhì)的界面面積[3-4]。有利于油釋放的另一種方法則是通過適當(dāng)?shù)拿覆糠炙鈦喡樽鸭?xì)胞壁，獲得高提取產(chǎn)率的亞麻籽油[5-6]。以往研究表明，對(duì)于不同種子，使用酶輔助預(yù)處理顯示微弱的促進(jìn)效果，即與未經(jīng)處理的樣品相比，提取產(chǎn)率提高2%～12%[7-8]。如此小的改進(jìn)使得研究人員放棄了這一方面的調(diào)查研究。然而，以往研究只考慮較短的反應(yīng)時(shí)間（一般為15～120 min），缺少對(duì)長(zhǎng)時(shí)間酶處理的研究。

植物細(xì)胞被一個(gè)由碳水化合物分子（纖維素、半纖維素和果膠多糖）和蛋白質(zhì)組成復(fù)雜的細(xì)胞壁基質(zhì)所包圍。為獲得更高的出油率，酶制劑應(yīng)該具有廣泛的活性以破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)；此外，蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH的溶解也會(huì)破壞基質(zhì)的穩(wěn)定，加速油進(jìn)入溶劑相的過程[9]。有報(bào)道稱，纖維的存在阻止酶進(jìn)入蛋白質(zhì)。在酶促水解中加入纖維素酶和果膠酶，在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，可使蛋白酶更容易接觸蛋白質(zhì)，從而提高消化率。總之，當(dāng)考慮到幾種酶類型的協(xié)同活性時(shí)，預(yù)測(cè)可以獲得更好的提取產(chǎn)率。

試驗(yàn)通過將纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的混合物輔助提取亞麻籽油開展研究。采用酶法進(jìn)行前處理，探究pH、濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、顆粒大小等條件對(duì)亞麻籽油提取產(chǎn)率的影響，以期為酶預(yù)處理法在提高亞麻籽油提取產(chǎn)量中的應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

亞麻籽（2009年9月在中國(guó)云南產(chǎn)區(qū)收獲的紅色品種亞麻中收集）；根據(jù)亞麻籽的結(jié)構(gòu)組成，選擇4種不同類型的酶，分別為纖維素酶（No. 22178，由黑曲霉制得）、半纖維素酶（木葡聚糖，No. X2753）、果膠酶（No. P2611，由棘孢曲霉產(chǎn)生）、蛋白酶（No. 93614，由豬胰腺產(chǎn)生），均購(gòu)自Fluka Sigma- Aldrich公司；其他試劑均為分析純或更高純度。

1.2 試驗(yàn)流程和方法

1.2.1 種子制備、粉碎和篩選

在亞麻酒發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)移亞麻汁時(shí)收集種子，并通過傾析和篩分從果肉和果皮中分離出來。第1次清洗去除漂浮在水面上未成熟的顆粒。在至少3 d內(nèi)，在4 ℃下用磁棒輕輕攪拌下，將種子用水（200 g/L）洗滌幾次，1 d換2次水，直到觀察到最低恒定濁度。將凈化后的種子用乙醇洗滌，在室溫（約25 ℃）風(fēng)干，并在使用前在4 ℃儲(chǔ)存。在國(guó)內(nèi)咖啡機(jī)上進(jìn)行研磨，將顆粒分為幾種標(biāo)準(zhǔn)篩分（＜0.50，0.50～0.60，0.60～0.71，0.71～1.0，1.0～1.4，1.4～2.0和＞2.0 mm）。

1.2.2 酶化處理

基于前期研究，在所有試驗(yàn)中，酶化懸浮液與種子之比保持在等于4 mL/g（干基）。用檸檬酸和磷酸氫鈉的緩沖溶液固定pH。10 g粉碎的種子用酶促纖維素酶、蛋白酶、木聚糖酶和果膠酶的混合液進(jìn)行處理。反應(yīng)在200 r/min的連續(xù)攪拌下等溫進(jìn)行，并通過用液氮冷凍懸浮液來停止。通過冷凍干燥燒瓶中的內(nèi)容物除去水。

1.2.3 亞麻籽油的提取

使用150 mL正己烷在索氏提取器（50 mL容量；23 mm×100 mm筒）中進(jìn)行常規(guī)萃取4 h。之前的測(cè)試表明，4 h就足以確保最大限度地提取，此外，為確保合成油不攜帶水，提取的樣品在真空下通過G1燒結(jié)玻璃過濾器中的無(wú)水硫酸鈉，并在30 ℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)回收溶劑。將油轉(zhuǎn)移到快速真空管中，通過離心蒸發(fā)進(jìn)行干燥。干燥后的亞麻籽油稱取其質(zhì)量，計(jì)算其提取產(chǎn)率（用η表示）。該過程的產(chǎn)量以從100 g干亞麻籽中提取的油量表示。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分析幾個(gè)變量對(duì)萃取產(chǎn)率的影響，即反應(yīng)時(shí)間（t）、溫度（T）、pH、粒徑（dp）以及酶促混合液的濃度（C）。反應(yīng)時(shí)間為8，16，24，48和120 h；溫度為30，40和50 ℃；pH范圍為3～7；粒徑為1.0～1.4 mm和小于0.5 mm；研究2組濃度，分別為C1（纖維素酶=29 U/g、蛋白酶=1 191 U/g、木聚糖酶=21 U/g和果膠糖酶=569 U/g）和C2（纖維素酶=72 U/g、蛋白酶= 2 977 U/g、木聚糖酶=55 U/g和果膠素酶=1 708 U/g）。

2 結(jié)果和討論

2.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)提取產(chǎn)率影響分析

分別討論反應(yīng)時(shí)間、pH、溫度、酶濃度和粒徑對(duì)提取產(chǎn)率的影響。在圖1中，觀察到η隨時(shí)間的增長(zhǎng)趨勢(shì)，在反應(yīng)時(shí)間為8，16，24，48和120 h時(shí)，測(cè)定的增量（用D表示）為8.9%，19.5%，46.5%，60.2%和136%。結(jié)果表明，提取產(chǎn)率隨著時(shí)間推移而持續(xù)增加。在較短時(shí)間內(nèi)，提取產(chǎn)率的提升不夠明顯。值得注意的是，大多數(shù)酶前處理的研究只考慮較小的反應(yīng)時(shí)間（一般為0.25～2 h），因增量低于15%，故導(dǎo)致酶處理和酶提取同時(shí)進(jìn)行的研究一般顯示出相當(dāng)令人失望的結(jié)果。8 h后，與對(duì)照組相比，僅實(shí)現(xiàn)一個(gè)很小的增量D=8.86%，但在24 h內(nèi)，其值達(dá)到46.5%，明顯超過大多數(shù)早期的研究。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到120 h時(shí)，提取產(chǎn)率提高達(dá)到163%。由于24 h時(shí)，提取增量隨時(shí)間呈二次方變化，而后出現(xiàn)拐點(diǎn)，因此24 h被認(rèn)為是時(shí)間長(zhǎng)度和提取產(chǎn)率提高（46.5%）之間的折中點(diǎn)，盡管其他參數(shù)尚未被考慮和優(yōu)化。

圖1 不同提取時(shí)間對(duì)提取產(chǎn)率影響

2.2 pH對(duì)提取產(chǎn)率影響分析

遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的值會(huì)使蛋白質(zhì)組學(xué)基質(zhì)不穩(wěn)定，能促進(jìn)種子油的去除，且蛋白質(zhì)本身會(huì)受到pH調(diào)節(jié)的影響，故本試驗(yàn)研究pH對(duì)提取產(chǎn)率的影響分析。其他的參數(shù)設(shè)定在t=24 h，T=40 ℃，dp=1.0～1.4 mm，濃度C1。每一種酶都有一個(gè)最佳的pH，其性能最高。當(dāng)幾種酶在相同的條件下共同作用時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生不同行為。不同種酶的pH為：果膠酶，pH 3.5；纖維素酶，pH 5；半纖維素酶，pH 4～6；蛋白酶，pH 7.6。由于找到合適的pH存在難度，也對(duì)此進(jìn)行研究。

根據(jù)圖2顯示的結(jié)果，評(píng)估最高pH測(cè)試的最小增量（pH 7），其中η=8.65%，D（產(chǎn)率增量）=29.9%。對(duì)于其他的pH，測(cè)量到更好的結(jié)果，即pH 5的D= 57.7%，pH 4的D=106%和pH 3的D=107%。由此可以得出結(jié)論，D穩(wěn)定在pH 4附近，它達(dá)到三位數(shù)，并開始接近pH 6時(shí)達(dá)到的極端值t=120 h（D=136%）。

圖2 不同提取pH對(duì)提取產(chǎn)率影響

在pH 4，果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶明顯受到青睞，而蛋白酶不在最佳pH范圍內(nèi)。可能是細(xì)胞壁基質(zhì)變形的協(xié)同效應(yīng)及酶活性造成上述顯著增量的原因[10]。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)提取產(chǎn)率影響分析

總的來說，對(duì)于溫度的影響，文獻(xiàn)的報(bào)道并不一致。雖然在一些油籽案例中，溫度是一個(gè)基本參數(shù)，它也被證明在其他方面沒有顯著影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)大的增量，即D=45.2%在30 ℃，D=46.5%在40 ℃，和D=0.751%在50 ℃。

反應(yīng)溫度對(duì)提取產(chǎn)率影響的試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，隨著反應(yīng)溫度的提高，亞麻籽油的提取產(chǎn)率增加，在反應(yīng)溫度40 ℃是提取產(chǎn)率達(dá)到最大值，在50 ℃時(shí)沒有增加（D=0.751%）反而降低，這表明雖然高溫不會(huì)影響油本身的質(zhì)量，但在高溫下可能使一些酶已經(jīng)喪失活性，從而降低它們的回收和再利用的可能性。故選擇反應(yīng)溫度為40 ℃為最佳的提取溫度。

圖3 不同反應(yīng)溫度對(duì)提取產(chǎn)率影響

2.4 酶處理濃度對(duì)提取產(chǎn)率影響分析

在其余的參數(shù)與基礎(chǔ)情況一致，即t=24 h，T=40 ℃、pH 6和dp=1.0～1.4 mm的基礎(chǔ)上，研究酶濃度的影響，結(jié)果如圖4所示。對(duì)于濃度水平C2，結(jié)果與對(duì)照組相比，有顯著改善：η=12.0%和D=80.2%，而在濃度水平C1時(shí)僅增強(qiáng)D=46.5%。

圖4 不同酶處理濃度對(duì)提取產(chǎn)率影響

濃度C2時(shí)，首先確定pH對(duì)提取產(chǎn)率的影響。再確定所有其他參數(shù)（反應(yīng)時(shí)間、溫度、平均粒徑、水籽比和攪拌速率）與基本情況一致。

pH 4～7時(shí)，濃度C2的η變化的趨勢(shì)與濃度C1時(shí)接近。在pH 3時(shí)，沒有檢測(cè)到由于濃度而增加的增量，因?yàn)镈（C1）=107%≈D（C2）=110%。結(jié)果表明，pH 4為最佳pH，與未處理的材料相比，最大的提取產(chǎn)率達(dá)到137%。

必須強(qiáng)調(diào)的是，濃度可能會(huì)掩蓋其他參數(shù)。實(shí)際上，高濃度可能會(huì)抵消其他非優(yōu)化變量的微弱影響。如較高的反應(yīng)時(shí)間需要較低的酶濃度，反之亦然。因此，應(yīng)該始終提出一個(gè)最適方案，因?yàn)槊傅某杀臼敲柑幚淼慕?jīng)濟(jì)可行性的基礎(chǔ)。考慮到濃度C2的成本幾乎是濃度C1的2倍或3倍，D（C1，pH 4）=106%和D（C2，pH 4）=137%，首選低濃度C1。

2.5 粒徑對(duì)提取產(chǎn)率影響分析

亞麻籽的機(jī)械處理對(duì)提取產(chǎn)率有很大影響，因?yàn)樗蚱屏酥参锛?xì)胞壁，增加了亞麻籽油提取產(chǎn)率。因此，粒徑越小，提取產(chǎn)率就越高。然而，在工業(yè)加工上并不推薦，因?yàn)樵诠I(yè)上加工如此精細(xì)的粉末，對(duì)含油量高、結(jié)構(gòu)弱的材料在暴露于溶劑流中時(shí)會(huì)坍塌并失去其大孔性，從而降低了均勻性和滲透性。故本試驗(yàn)研究粒徑對(duì)亞麻籽油的提取產(chǎn)率的影響。

使用未處理的磨削樣品（即對(duì)照組試驗(yàn)）測(cè)定dp的影響。相應(yīng)地，對(duì)于dp=1.0～1.4 mm，η=6.66%（如圖5所示），當(dāng)dp＜0.5 mm時(shí)，產(chǎn)率為13.5%（圖5），這個(gè)值比前者高出130%，突出粒徑對(duì)油籽可提取性的作用[8]。

大多數(shù)早期關(guān)于酶處理的研究沒有考慮粒徑，完成水處理時(shí)，完整的種子經(jīng)常浸入水介質(zhì)中并原位研磨，沒有進(jìn)一步分類。然而，這個(gè)參數(shù)絕對(duì)不可忽視，當(dāng)比較已處理/未處理樣品的結(jié)果時(shí)，會(huì)得出誤導(dǎo)的結(jié)論。為研究dp對(duì)酶反應(yīng)的影響，試驗(yàn)條件采用先前分析的條件，即t=24 h、T=40 ℃、pH 4和濃度C1。并且進(jìn)行粒徑小于0.5 mm的試驗(yàn)，考慮與對(duì)照2進(jìn)行比較。

當(dāng)顆粒dp＜0.5 mm時(shí)，η=19.5%，即比對(duì)照1增加D=193%。由于酶作用導(dǎo)致，帶來的理論上的增強(qiáng)明顯小于這個(gè)值，因?yàn)棣?19.5%只比對(duì)照2多了27.5%（圖5）。這個(gè)結(jié)果是由于這個(gè)事實(shí)許多較小顆粒的油體在研磨后已經(jīng)暴露出來[9]。盡管如此，酶的處理在dp＜0.5 mm仍有其意義。

圖5 不同樣品粒徑對(duì)提取產(chǎn)率影響

3 結(jié)論

通過機(jī)械和酶預(yù)處理的結(jié)合，可以提高亞麻籽油提取產(chǎn)率。雖然機(jī)械加工會(huì)產(chǎn)生更快、更便宜的結(jié)果，但在工業(yè)層面上處理小粒直徑有限。這一事實(shí)促使針對(duì)酶處理對(duì)增加亞麻籽油提取的影響開展研究。

試驗(yàn)表明，濃度和處理時(shí)間增加后產(chǎn)量會(huì)增加。相比之下，pH和溫度則是先增后降。關(guān)于酶混合液的濃度，所研究的最低水平（即纖維素酶29 U/g、蛋白酶1 191 U/g、木聚糖酶21 U/g和果膠酶569 U/g）取得積極結(jié)果。盡管如此，還是必須進(jìn)行精確的經(jīng)濟(jì)評(píng)估，以便根據(jù)酶的成本而選擇適當(dāng)?shù)臐舛取ｊP(guān)于粒徑，酶處理對(duì)較大的直徑有更大的影響。總體上，提出亞麻籽油提取的優(yōu)化參數(shù)：t=24 h、pH 4、溫度30～40 ℃、顆粒直徑范圍1.0～1.4 mm，濃度C1。在這些條件下，提取產(chǎn)率為13.7%，比未處理的樣品增加106%。在t=120 h、pH 4、T=40 ℃、dp=1.0～1.4 mm，濃度C1時(shí)，得到最佳提取產(chǎn)率17.5%，增量為163%。這一研究表明采用酶促預(yù)處理法具有數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，能增強(qiáng)亞麻籽油提取產(chǎn)率，為酶預(yù)處理法在提高亞麻籽油提取產(chǎn)率中的應(yīng)用提供借鑒。