關黃柏葉不同炮制品的總黃酮含量測定及抗氧化活性

魏穎，包海鷹*，劉穎，和生

1. 吉林農業大學中藥材學院（長春 130118）；2. 吉林農業大學藥用菌物資源及其開發利用重點研究室（長春 130118）

關黃柏（Phellodendron amurenseRupr.）學名為黃檗，是蕓香科落葉喬木，在我國吉林、黑龍江、遼寧等省及內蒙古地區均有分布[1]，其干燥樹皮是我國的傳統中藥黃柏的來源之一。2020年版《中華人民共和國藥典》中記載，關黃柏以其干燥樹皮入藥，是清熱燥濕的代表藥[2]。藥理研究表明關黃柏具有抗氧化、抗炎鎮痛和抗痛風等作用[3-5]；據相關文獻報道，關黃柏還可用作開胃性食品添加劑的原材料[6]，可在食品的原有味覺基礎上增加清涼、清爽以及清凈感等，可應用于甜點類和飲品類等，其中總黃酮類物質發揮重要作用[1]。吉林省靖宇縣地區的民眾有將關黃柏葉進行制茶泡水飲用的習俗，長期飲用，可以達到降血糖的功效[1]。

中藥關黃柏在我國使用歷史悠久，但是關于關黃柏樹的葉子及其炮制品的抗氧化活性對比研究未見報道。據文獻記載，關黃柏樹的樹葉或果實中富含黃酮類物質，樹皮富含生物堿[7]。試驗對關黃柏葉及其不同炮制品進行總黃酮和總生物堿含量測定。黃酮類化合物具有良好的抗氧化活性[8-10]，對比研究關黃柏葉及其不同炮制品的抗氧化活性，為關黃柏葉資源的可持續開發利用提供依據，并為關黃柏葉及不同炮制品作為新型食品能源提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

關黃柏葉（均采摘自吉林省靖宇縣東坪苗木種植專業合作社的關黃柏人工栽培基地的矮化和灌木化的關黃柏）；關黃柏葉不同炮制品（實驗室炮制獲得；發酵炒制的關黃柏葉是指關黃柏原葉經過日曬、萎凋、發酵、揉捻、團揉、炒干而得；炒制的關黃柏葉是指關黃柏原葉經過日曬、殺青、揉捻、團揉、炒干而得）；關黃柏藥材（樹皮，購自康美藥業股份有限公司，均由吉林農業大學包海鷹教授鑒定）。

ELX800酶標儀（廣州市番禺區華鑫科技有限公司），FA2104-N電子分析天平（上海精其儀器有限公司），HH-4數顯恒溫水浴鍋（常州市江南實驗儀器廠）。

鹽酸小檗堿標準品（上海源葉生物科技有限公司）；蘆丁標準品（上海源葉生物科技有限公司）；維生素C標準品（天津百倫斯生物技術有限公司）；ABTS（上海金穗生物科技有限公司）；DPPH（上海金穗生物科技有限公司）；其他試劑皆為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮含量測定方法

參照文獻[11-13]方法測定，稍作修改。稱取5.5 mg蘆丁標準對照品，用蒸餾水溶解制成550 μg/mL測定液。分別吸取不同體積的標準品溶液于10 mL容量瓶中，各加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液，1 mL的10%硝酸鋁溶液，靜置8 min，加2 mL的10 g/100 mL氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容。在510 nm處測定吸光度。以蘆丁質量濃度（mg/mL）和吸光度繪制標準曲線，計算回歸方程。

樣品總黃酮含量按上述方法在510 nm處測量吸光度，計算樣品中總黃酮含量。

1.2.2 總生物堿測定方法

按照文獻[14]方法，稍作修改。稱取0.024 4 g鹽酸小檗堿，用100 mL pH 4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解。量取2 mL小檗堿標準品液，加入2 mL溴酚藍溶液，制成標準品測定液。分別吸取不同體積的標準品溶液于10 mL容量瓶中，加緩沖液定容至10 mL，移取2 mL至分液漏斗中，加2 mL溴酚藍溶液，用10 mL氯仿振蕩提取5 min。取氯仿層，用濾紙將氯仿層過濾至25 mL容量瓶中，用氯仿提取3次，每次5 mL，加氯仿定容。在417 nm處測量吸光度，以吸收度為縱坐標，小檗堿質量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，并獲得回歸方程。

樣品總生物堿含量測定：精密稱取樣品0.25 g，按上述方法測定吸收度，計算樣品中總生物堿含量。

1.2.3 抗氧化活性研究方法

1.2.3.1 對DPPH自由基的清除率的測定

DPPH自由基是由于其較穩定，被廣泛應用于測定自由基的清除能力[15]，其無水乙醇溶液呈紫色[16]。

參照文獻[17-18]方法測定，對此稍作修改，將各樣品稀釋成不同質量濃度（0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL）樣品，取1 mL于刻度試管中，加入1 mL DPPH-乙醇溶液，混合均勻，在室溫下靜置30 min，測定517 nm下的吸光度，以維生素C作對照。根據式（1）計算清除率。

式中：Ai為樣品的吸光度；Aj為無水乙醇溶液代替DPPH-乙醇溶液的吸光度；A0為空白樣品的吸光度。

1.2.3.2 對ABTS自由基清除率的測定

抗氧化劑與ABTS自由基配對后，使藍綠色的溶液褪色，退色越明顯則表示抗氧化劑的抗氧化能力越強[19]。

參照文獻[19]方法測定，稍作修改。將50 mL 7.4 mmol/mL的ABTS和50 mL 2.6 mmol/mL的過硫酸鉀溶液混合，將其至于暗處放置12～16 h，制成ABTS儲備液。用60%乙醇稀釋，使儲備液吸光度在734 nm為0.70± 0.02，獲得ABTS工作液。取1 mL不同濃度樣品溶液，加入6 mL ABTS工作液，室溫下暗處靜置6 min，在734 nm波長下測量吸光度，以維生素C作對照。根據式（2）計算清除率。

式中：Ai為樣品吸光度，Aj為蒸餾水代替ABTS工作液吸光度；A0為空白樣品吸光度。

1.2.3.3 對羥基自由基清除率的測定

羥基自由基（·OH）比較活潑，可以損傷如核酸、脂質或氨基酸等生物大分子[20]。

參照文獻[21-22]方法測定，稍作修改。取2 mL不同濃度樣品溶液，加入2 mL的9 mmol/L FeSO4溶液，2 mL的9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液及2 mL的8.8 mmol/L H2O2溶液，37 ℃下反應30 min，510 nm波長下測量吸光度，以維生素C作對照，按式（3）計算清除率。

式中：Ai為樣品的吸光度；Aj為無H2O2溶液的吸光度；A0為空白樣品的吸光度。

1.2.3.4 對超氧陰離子自由基清除率的測定

參照文獻[23-24]方法測定，稍作修改。分別取1.0 mL不同濃度樣品溶液于試管中，加入4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液，加入0.2 mL鄰苯三酚溶液后搖勻，在37 ℃下的水浴15 min，加入1.0 mL濃鹽酸。在299 nm處測量吸光度，以維生素C作對照，按式（4）計算清除率。

式中：A0為蒸餾水吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

1.2.3.5 鐵原子還原能力的測定

參照文獻[13]方法測定，稍作修改。分別取0.5 mL不同濃度樣品溶液，加入3 mL（0.2 mol/L、pH 6.8）磷酸鹽緩沖液，3 mL的10 mg/mL鐵氰化鉀，混勻后于50 ℃水浴20 min，冷卻后加入3 mL的100 mg/mL三氯乙酸，混勻后放置30 min。離心，移取2.5 mL上清液，加入3 mL蒸餾水及0.5 mL的1 mg/mL FeCl3，靜置10 min，于700 nm處測定吸光度，以維生素C作對照，按式（5）計算還原能力。

式中：Ai為樣品溶液吸光度；A0空白樣品吸光度。

1.2.4 數據分析

所有試驗均重復3次，試驗數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 26.0分析軟件進行數據分析，p＜0.05為差異具有顯著性，p＜0.01為差異具有極顯著性。用Graphpad prism 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 樣品總黃酮含量測定結果

標準品溶液按照1.2.1的方法繪制標準曲線，計算的回歸方程Y=1.250 2X+0.000 4，r=0.999 3，表明蘆丁對照品在0～0.004 mg/mL有良好線性關系，標準曲線見圖1，樣品總黃酮含量結果見表1。

圖1 蘆丁標準曲線

由表1可知，與關黃柏樹皮的總黃酮含量相比，關黃柏原葉、發酵的關黃柏葉總黃酮含量和炒制的關黃柏葉總黃酮含量極顯著升高，其中發酵炒制的關黃柏葉的總黃酮含量最高，樣品中的總黃酮含量順序為：發酵炒制的關黃柏葉＞關黃柏原葉＞炒制的關黃柏葉＞關黃柏樹皮。

表1 樣品中總黃酮含量測定結果

2.2 樣品總生物堿含量測定結果

標準品溶液按照1.2.2的方法繪制標準曲線，求得回歸方程為Y=145.66X-0.007 4，r=0.999 1，表明生物堿質量濃度在0.000 5～0.003 mg/mL有良好線性關系，標準曲線見圖2，樣品總生物堿含量見表2。

圖2 小檗堿標準曲線

由表2可知，與關黃柏樹皮的總含量相比，關黃柏原葉的總生物堿顯著降低（p＜0.05）、發酵的關黃柏葉總黃酮含量和炒制的關黃柏葉總黃酮含量極顯著降低（p＜0.01），其中發酵炒制的關黃柏葉的總黃酮含量最低，樣品中的總生物堿含量順序為關黃柏樹皮＞關黃柏原葉＞炒制的關黃柏葉＞發酵炒制的關黃柏葉。

表2 樣品中總生物堿含量測定結果

2.3 抗氧化活性結果

2.3.1 對DPPH自由基清除能力測定結果

由圖3可知，在0.2～1.0 mg/mL質量濃度內，不同樣品和維生素C對DPPH自由基的清除率隨質量濃度升高而逐漸增強。其中，發酵炒制的關黃柏葉清除DPPH自由基的能力最強，在1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率為80.25%，高于其他3個樣品，與維生素C對DPPH自由基的清除率最接近。

圖3 不同質量濃度樣品與維生素C對DPPH自由基的清除率

2.3.2 對ABTS自由基清除能力測定結果

由圖4可知，在0.2～1.0 mg/mL質量濃度內，不同樣品和維生素C對DPPH自由基的清除率隨質量濃度升高而逐漸增強。其中，發酵炒制的關黃柏葉對ABTS自由基的清除能力最強，在1.0 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率為94.35%，高于其他3個樣品，與維生素C對ABTS自由基的清除率最接近。

圖4 不同質量濃度樣品與維生素C對ABTS自由基的清除率

2.3.3 對羥基自由基清除能力測定結果

由圖5可知，在0.2～1.0 mg/mL質量濃度內，不同樣品和維生素C對羥基自由基的清除率隨質量濃度升高而逐漸增強。其中，發酵炒制的關黃柏葉對羥基自由基的清除能力最強，在1.0 mg/mL時，對羥基自由基的清除率為92.27%，高于其他3個樣品，與維生素C對羥基自由基的清除率最接近。

圖5 不同質量濃度樣品與維生素C對羥基自由基的清除率

2.3.4 對超氧陰離子自由基清除能力測定結果

由圖6可知，在0.2～1.0 mg/mL質量濃度內，不同樣品和維生素C對超氧陰離子自由基的清除率隨質量濃度升高而逐漸增強。其中，發酵炒制的關黃柏葉對超氧陰離子的清除能力最強，在1.0 mg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除率為89.24%，高于其他3個樣品，與維生素C對超氧陰離子自由基的清除率最接近。

圖6 不同質量濃度樣品與維生素C對超氧陰離子自由基的清除率

2.3.5 對鐵原子的還原能力測定結果

由圖7可知，在0.2～1.0 mg/mL質量濃度內，不同樣品和維生素C對鐵原子的還原力隨質量濃度升高而逐漸增強。其中，發酵炒制的關黃柏葉對鐵原子的還原能力最強，在1.0 mg/mL時，對鐵原子的還原能力為0.713，高于其他3個樣品，與維生素C對鐵原子的還原能力最接近。

圖7 不同質量濃度樣品與維生素C對鐵原子的還原能力

3 結論

試驗對關黃柏葉及其不同炮制品進行總黃酮和總生物堿含量對比測定，以關黃柏樹皮作為對照，總黃酮含量順序為發酵炒制的關黃柏葉＞關黃柏原葉＞炒制的關黃柏葉＞關黃柏樹皮。總生物堿含量順序為關黃柏樹皮＞關黃柏原葉＞炒制的關黃柏葉＞發酵炒制的關黃柏葉。發酵炒制的關黃柏葉中總黃酮含量，是關黃柏樹皮的3.19倍，關黃柏原葉的1.55倍；而發酵炒制的關黃柏葉中的總生物堿含量是關黃柏樹皮的0.53倍，關黃柏原葉的0.705倍，說明發酵炒制可以增加關黃柏葉中總黃酮含量，降低總生物堿含量。

采用DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除率和對鐵原子的還原能力對關黃柏葉及其不同炮制品和關黃柏樹皮進行抗氧化活性對比評價。結果表明，關黃柏原葉、發酵炒制的關黃柏葉、炒制的關黃柏葉及關黃柏樹皮均具有抗氧化活性，并且抗氧化活性隨著樣品質量濃度增加而增強。在5種抗氧化活性試驗中，發酵炒制的關黃柏葉的抗氧化活性均為最強，與維生素C最接近，其他樣品的抗氧化活性順序為關黃柏原葉＞炒制的關黃柏葉＞關黃柏樹皮，說明發酵炒制方式可以增加關黃柏葉中的總黃酮含量，使其抗氧化活性增強，針對發酵炒制后關黃柏葉中的黃酮類含量增加的問題有待進一步研究。

結合關黃柏葉及其不同炮制品富含黃酮類化合物并且具有良好的抗氧化活性，對關黃柏葉及其不同炮制品進行食用或藥用，不僅能達到提高機體的抗氧化能力、降低血糖等多種功效，并且能代替關黃柏樹皮，避免關黃柏樹木遭到破壞，使關黃柏葉資源可持續再生；關黃柏葉及其不同炮制品也可作為新型食品添加劑，起到開胃健脾的作用。試驗說明關黃柏葉及其不同炮制品具有廣闊市場前景，可將人工栽培和矮化的關黃柏樹的葉子合理開發和利用。