貴州不同品種花椒麻味物質(zhì)的測(cè)試分析

程玉波，魏浩華，曾欽朦，羅紅，王港*

1. 晴隆縣林業(yè)局（黔西南州 561400）；2. 江西馬頭山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局（撫州 335300）；3. 貴州省林業(yè)科學(xué)研究院（貴陽(yáng) 550000）

花椒屬蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）的植物花椒（Zanthoxylum bungeanum）或青椒（Zanthoxylum schinifolium）的干燥成熟果皮[1]，其對(duì)氣候的適應(yīng)性強(qiáng)、耐干旱、根系發(fā)達(dá)，因此它具有良好的生態(tài)價(jià)值，花椒主要分布在亞洲、美洲、非洲等熱帶及亞熱帶地區(qū)[2]。中國(guó)不僅是花椒原產(chǎn)國(guó)，而且還是主產(chǎn)國(guó)之一，在2 000多年前我國(guó)就有把花椒作為防腐劑和香物[4]的記錄。據(jù)中國(guó)植物志記載，中國(guó)有約45種花椒，13種變種，主要分布在長(zhǎng)江以南及西南的地區(qū)[5]。貴州省是花椒的重要產(chǎn)區(qū)之一，成為當(dāng)?shù)卮迕竦慕?jīng)濟(jì)來(lái)源。近年來(lái)，花椒被列為貴州省農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命12個(gè)農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)，并在德江和貞豐等縣已經(jīng)形成規(guī)模化的發(fā)展，且貴州貞豐縣有著“中國(guó)花椒之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[6]。花椒是“藥食同源”植物，具有巨大的藥用價(jià)值，在治療麻疹病[7]、瘧疾[8]和糖尿病[9]等疾病中效果較好，并且還可用于解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌等[10-11]。

現(xiàn)有研究報(bào)道中，花椒主要的化學(xué)成分有酰胺類(lèi)物質(zhì)[12]、揮發(fā)油[13]、黃銅類(lèi)化合物[14]、生物堿[15]、萜類(lèi)[16]、多酚[17]、維生素E及人體必需的8種氨基酸等成分[18]。酰胺類(lèi)物質(zhì)主要存在于花椒的果皮中，主要成分包括羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素或酰胺化合物的異構(gòu)體[19-20]，它是花椒麻味的主要來(lái)源，可作為花椒內(nèi)部質(zhì)量的指標(biāo)，研究者已從中分離出30多種酰胺類(lèi)物質(zhì)[21-22]，其部分化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。研究發(fā)現(xiàn)α-山椒素與γ-山椒素會(huì)產(chǎn)生灼燒感，β-山椒素產(chǎn)生麻木感，羥基-α-山椒素產(chǎn)生刺痛感等[23]。酰胺類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和種類(lèi)與花椒的產(chǎn)地、品種等因素有關(guān)[24]。

近年來(lái)，大部分對(duì)花椒麻味物質(zhì)的研究主要集中在甘肅、四川、陜西、重慶等全國(guó)聞名的種植基地所產(chǎn)的花椒，而貴州花椒雖然種植面積不斷擴(kuò)大，本土花椒也受廣大人民的喜愛(ài)，但對(duì)其的研究報(bào)道較少，缺乏支撐數(shù)據(jù)，導(dǎo)致貴州花椒的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力較弱，品牌效應(yīng)較差。試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)貴州不同品種花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，分析貴州不同品種花椒的品質(zhì)，并進(jìn)行對(duì)比分析，旨為貴州花椒的品質(zhì)鑒定提供科學(xué)數(shù)據(jù)，也為貴州花椒產(chǎn)業(yè)的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貴州貞豐頂壇花椒、云南昭通青花椒、重慶江津九葉青花椒（見(jiàn)表1）。經(jīng)自然晾干后去籽，備用。

羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素對(duì)照品（純度≥98.00%，成都曼思特生物科技公司）；去離子水（美國(guó)MILLIPORE公司）；甲醇、乙腈（成都杰銳科技有限公司）；超聲清潔器（KH-50B，昆山超聲儀器有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW-100，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物提取

采用超聲波提取方法可提高提取率，能夠在花椒中提取更多的有效成分[25]。將花椒樣品用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW-100）進(jìn)行粉碎，且過(guò)0.250 mm（60目）篩，混合均勻進(jìn)行稱(chēng)量（約5 g）；每個(gè)樣品倒入250 mL帶塞子的錐形燒瓶中加入50 mL甲醇；使用超聲清潔器（KH-50B），將錐形燒瓶放入其中，在30 ℃下進(jìn)行超聲處理30 min；冷卻至室溫加入甲醇并充分振搖，進(jìn)行過(guò)濾（0.22 μm膜）。

稱(chēng)取羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素對(duì)照品，將其溶解于甲醇中至質(zhì)量濃度為2 mg/mL；先過(guò)濾（0.22 μm膜），再將溶液注入高效液相色譜（HPLC）中。

1.2.2 HPLC色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；以乙腈-去離子水為流動(dòng)相梯度洗脫（A：乙腈，B：去離子水）。梯度程序：35% A，0 min；35%～40% A，5～10 min；45%～65% A，25～50 min；90%～35% A，55～60 min。洗脫流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm，進(jìn)樣量2 μL，時(shí)間60 min。

1.2.3 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

取不同品種的羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素對(duì)照品溶液，采用HPLC檢測(cè)外標(biāo)法，按照1.2.2中色譜條件進(jìn)樣，并測(cè)定出響應(yīng)值（3個(gè)峰面積的總和），每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程，并計(jì)算出各花椒麻味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜分析

通過(guò)HPLC法檢測(cè)花椒麻味物質(zhì)的溶液，得到色譜圖（圖2）。圖2A是羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素對(duì)照品溶液的色譜圖，分別在38.030，26.360及27.566 min出峰，分離度在1.21～ 11.67 min；圖2B是不同花椒品種麻味物質(zhì)溶液的色譜圖，不同花椒品種色譜峰的分離度與色譜柱分離度高，均達(dá)到基線分離。說(shuō)明采用HPLC法對(duì)花椒麻味物質(zhì)分離效果好，峰無(wú)分叉，也無(wú)拖尾，結(jié)果可靠。

圖2 HPLC色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與分析

精密吸取100 μg/mL的花椒麻味物質(zhì)對(duì)照品溶液，用甲醇進(jìn)行稀釋至質(zhì)量濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.20和1.00 μg/mL，按照1.2.2的色譜條件依次進(jìn)樣，測(cè)定羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素對(duì)照品溶液的響應(yīng)值，即3個(gè)峰的面積總和，每個(gè)樣品平行測(cè)3次，以其質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程（表2）。不難發(fā)現(xiàn)，各回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995，說(shuō)明不同花椒品種的麻味物質(zhì)線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度

吸取對(duì)照品溶液（10 μL），按1.2.2的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣，共6次，測(cè)定羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素的峰面積，并計(jì)算其RSD，分別為1.13%，1.17%及1.06%，說(shuō)明HPLC色譜系統(tǒng)的精密度良好。

2.4 重復(fù)性

稱(chēng)取花椒樣品6份（每份稱(chēng)取0.5 g），根據(jù)1.2.1的方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣10 μL，按照1.2.2的色譜條件測(cè)定各麻味物質(zhì)的峰面積，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素的峰面積的SRSD分別為1.06%，1.24%和1.26%。說(shuō)明HPLC法的重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性

稱(chēng)取花椒粉末1 g（精確0.001 g），根據(jù)1.2.1的方法提取花椒麻味物質(zhì)，制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，吸取溶液（10 μL），按照1.2.2的色譜條件分別于0，2，4，8，16和24 h進(jìn)樣，評(píng)估其穩(wěn)定性，并記錄峰面積，計(jì)算出羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素峰面積的SRSD分別為1.35%，1.28%和1.46%，說(shuō)明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.6 加標(biāo)回收率

精密稱(chēng)取花椒粉末6份（每份0.25 g），分別加入適量對(duì)照品溶液，根據(jù)1.2.1的方法制備樣品，計(jì)算出不同花椒品種羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素的平均加標(biāo)回收率范圍在97.96%～平共處101.58%，SRSD值分別為1.77%，1.41%和1.59%，說(shuō)明HPLC法的準(zhǔn)確性較好。

2.7 花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同花椒品種麻味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，不同花椒品種麻味物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)從大到小依次為頂壇花椒-貞豐＞頂壇花椒-德江＞九葉青花椒-德江＞青花椒-德江，分別為52.566，49.771，47.612和47.021 mg/g。羥基-α-山椒素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，頂壇花椒-貞豐的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到45.377±2.069 mg/g，羥基-β-山椒素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍在3.875～7.733 mg/g，羥基-γ-山椒素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍在3.236～3.432 mg/g，羥基-α-山椒素是羥基-β-山椒素的5～10倍，羥基-γ-山椒素的10倍以上，說(shuō)明羥基-α-山椒素是花椒麻味物質(zhì)中的主要成分，頂壇花椒中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他品種花椒。

圖4 花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 結(jié)論與討論

采用HPLC法對(duì)貴州不同品種花椒麻味物質(zhì)（羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素及羥基-γ-山椒素）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，花椒麻味物質(zhì)的線性關(guān)系良好，R2≥0.995，分離效果較好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及加標(biāo)回收率的SRSD＜1.8，符合方法學(xué)考察的要求。從云南昭通、重慶江津及貴州貞豐引種在貴州德江進(jìn)行種植，結(jié)果表明，云南昭通青花椒羥基-α-山椒素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.262±1.214 mg/g，高于熊汝琴等[26]研究的昭通產(chǎn)青花椒的麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（12.429 mg/g）；重慶江津的九葉青花椒羥基-α-山椒素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.447±1.944 mg/g，高于原產(chǎn)地九葉青花椒的羥基-α-山椒素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（13.365 mg/g）的2倍以上[27]；引種到貴州德江不同花椒品種的麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于原產(chǎn)地，說(shuō)明貴州德江的生態(tài)環(huán)境適合種植云南青和九葉青花椒。

楊清山等[28]研究的四川金陽(yáng)青花椒麻味物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)（羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素）在25.54～32.30 mg/g；李般程等[29]研究的青花椒中，四川金陽(yáng)青花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在29～31 mg/g，云南昭通青花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在26～31 mg/g，重慶江津青花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在24～27 mg/g。貴州本地頂壇花椒也是青花椒的一種，其3種麻味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于云南青和九葉青花椒，貴州貞豐的頂壇花椒麻味物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)52.566 mg/g，貴州德江的頂壇花椒麻味物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.771 mg/g，均高于楊青山與李般程的研究結(jié)果，說(shuō)明貴州本地的頂壇花椒麻味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于一些知名的青花椒，為貴州本地特色產(chǎn)業(yè)的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，也為貴州頂壇花椒的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)。