云耳百云6號菌絲液體深層培養物發酵酒的研制

李發盛，黃劭蘭，黃雪星，歐娜，周興，何達崇

1. 廣西科學院生物研究所（南寧 530003）；2. 南寧市文華學校（南寧 530007）；3. 廣西科學院（南寧 530003）

食藥用真菌通過工業深層發酵方法生產其菌絲體及代謝產物都可以在短期內得到，利用這些發酵產物可以開發出新型營養飲料和營養保健食品，制備藥品保健美容化妝品、生產飼料蛋白等[1-2]。

發酵酒是指發酵后不需要經過一系列的化學反應，釀造的產物直接作為產品來飲用的酒類，其酒精度數偏低，多數用果類、粗糧類、乳制品類等為發酵材料，添加所需的酵母后直接發酵而成。隨著人們生活水平不斷提高，保健意識增強，酒類消費更加趨向于低酒精度、高保健效果的釀造酒，因此，兼具營養保健型的低酒精飲品具有很大發展空間[3]。

研究發現，與固體培養的子實體相比較，液體培養的菌絲體營養物質成分類似，且深層發酵具有低成本、高產量、生長周期短的優勢[3]。利用液體深層發酵培養的食藥用菌菌絲體進行發酵酒的研制也有文獻報道[4-9]，但使用液體深層發酵全培養物（含菌絲體及全部培養液）進行發酵酒的研制未見報道。

黑木耳（Auricularia auricular）是一種藥食同源的大型真菌，富含多種生物活性物質，包括可溶性糖、蛋白質、脂肪、礦質元素、維生素和粗纖維等營養物質以及黑色素、果膠、總酚和總黃酮等非營養物質，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤等生理活性，可用于防治冠心病、動脈硬化等心腦血管疾病，還能化解結石，預防宮頸癌、直腸癌及其他消化系統癌癥[10-11]。

廣西所產黑木耳俗稱云耳，同樣兼具營養和保健功能，只因產地、生態種的不同，其所含營養物質及各種生物活性物質的種類和數量與其他地域的黑木耳會有區別。云耳百云6號是從野生云耳子實體分離并經馴化獲得的生產性能較好的優良菌株，其子實體嫩脆爽滑香，是迄今為止廣西區內食藥用菌類獲得國家新品種認證的唯一一個本土種質資源，也填補了廣西食藥用菌栽培無本土種的空白。以云耳百云6號菌絲體深層發酵全液為原料，添加適量葡萄糖，經過膠體磨破碎均質后，加入酒精酵母發酵，稍調配可獲得一款口感好、富含營養和生物活性物質的低酒精度飲品，為云耳深加工拓寬新途徑，也為其他食藥用菌的精深加工提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

百云6號，系經過自然選育獲得的廣西本土優良云耳菌株，并已通過國家新品種認定，本所保藏。

Q303，糖化型根霉，從貴州輕工研究所引進，本所保藏。

1308，酒精酵母，華中農業大學提供，本所保藏。

1.2 供試培養基、試劑和儀器

百云6號斜面培養基（PDA培養基）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，VB10.01 g，瓊脂粉15 g，自來水1 000 mL，pH自然。

百云6號菌絲體優化液體培養基：馬鈴薯（去皮）10%；麩皮3%；葡萄糖2%；紅糖1.5%；蛋白胨0.3%；酵母粉0.15%；磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.3%；硫酸鎂（MgSO4）0.15%；維生素B1（VB1）1 mg/100 mL；微鹽1 mL/100 mL；pH 6.5；花生油6滴/ 100 mL。

1308斜面及液體培養基：12%甜酒汁，pH 6.0，斜面培養基加0.5%瓊脂粉。

主要試劑：試驗所涉及的藥品均為分析純。

主要儀器與設備：電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；恒溫振蕩培養箱（常州丹瑞實驗儀器設備有限公司）；膠體磨（廊坊市朗通機械有限公司）；手持糖量計（昆山宏達光學儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

圖1 發酵酒工藝流程

1.3.2 培養基制備

PDA斜面培養基：土豆去皮，取200 g切成粒狀，加1 000 mL水，煮沸30 min，用4層紗布過濾，濾液中加入其他組分，溶解后，定量至1 000 mL，調pH至6.0～6.5，用18 mm×180 mm試管分裝，加塞，于0.11 MPa滅菌30 min，趁熱擺斜面。

液體發酵培養基：麩皮篩去細粉，取30 g粗皮，加20倍水，于80±2 ℃水浴浸提約4 h；土豆去皮，取100 g切成粒狀，加400 mL水，于80±2 ℃水浴浸提約4 h。兩者用4層紗布過濾，濾液混合，加入其他組分，溶解后，定量至1 000 mL，調pH至6.0～6.5，用500 mL三角瓶分裝，150 mL/瓶，加蓋8層紗布及牛皮紙，于0.11 MPa滅菌30 min。

甜酒汁培養基：糯米加水浸泡10～12 h，瀝干水分，隔水蒸至熟透，趁熱打散冷卻至32 ℃左右，加入0.5%的麩皮和培養成熟的Q303根霉種，拌勻，倒入潔凈的容器內，厚度5～8 cm，中間打窩，加蓋，置于32 ℃恒溫培養箱培養32 h左右。加入3倍糯米量的60 ℃水，打散團塊，恒溫水浴鍋60 ℃糖化4 h，紗布抓濾得粗濾液，加入雞蛋清邊攪拌邊加熱至沸騰，用粗濾紙過濾得到清澈透明的甜酒汁，調整糖度13%、pH 6，分裝三角瓶，或加入0.5%瓊脂粉，按常規做成斜面培養基，于0.11 MPa滅菌30 min。

1.3.3 菌種培養

百云6號斜面種子培養：嚴格按照無菌操作要求，取1 mm2左右種塊轉接到新鮮的PDA斜面，于26 ℃培養10 d左右長滿斜面，再次轉接到PDA斜面培養基，于26 ℃培養至菌絲體蓋滿斜面，作為液體發酵種子待用。

酒精酵母1308的擴大培養：嚴格按照無菌操作要求，用接種環取1環菌落于新鮮的甜酒汁斜面培養基進行劃線接種，于28 ℃培養24 h。成熟后轉接到新鮮的500 mL三角瓶甜酒汁液體培養基中，于28 ℃靜置培養24 h左右待用。

1.3.4 百云6號菌絲液體搖床發酵

嚴格按照無菌操作要求，在超凈工作臺內，用接種刀將斜面種子切成1 mm2左右小種塊，然后用接種鏟移接種塊（盡量不帶培養基）到液體發酵培養基中，每支斜面種子接3～5個三角瓶。接種完畢，于26 ℃、180 r/min條件下發酵9 d。

1.3.5 酒精發酵

百云6號菌絲體液體發酵結束，將所有三角瓶內的正常培養物合并，按培養物總量的23%加入葡萄糖，經膠體磨破碎均質后，移入10 L玻璃缸內，加入10%的1308液體種子，攪拌均勻后，加蓋密封于室溫下（30±5 ℃）發酵30 d，過濾即為發酵原酒。

1.3.6 配制

發酵原酒配不同比例純正蜂蜜進行品評，得出最佳蜂蜜添加量。

1.4 成分檢測

委托廣西分析測試研究中心對發酵原酒進行成分檢測。檢測方法如下：

酒精度：GB 5009.225—2016第二法；總糖（以葡萄糖計）、總酸：GB/T 15038—2006；總酯：GB/T 10345—2007中8；碳水化合物：GB 28050—2011；蛋白質：GB 5009.5—2016第一法；總黃酮：SN/T 4592—2016；多糖：《配制白酒中枸杞多糖含量測定方法的研究》[12]；氨基酸：GB 5009.124—2016；色氨酸：GB/T 15400—2018；維生素A、維生素E：GB 5009.82—2016；維生素B1：GB 5009.84—2016；維生素B2：GB/T 5009.85—2016；鐵（Fe）、鋅（Zn）、鈣（Ca）：GB 5009.268—2016第二法；果膠（以半乳糖醛酸計）：NY/T 2016—2011；細菌總數：GB 4789.2—2016；大腸桿菌：GB 4789.3—2016第一法；沙門氏菌：GB 4789.4；金黃色葡萄球菌：GB 4789.10。

2 結果與分析

2.1 百云6號液體搖床發酵

以優化的液體培養基搖床發酵9 d，培養物似漿糊狀結束培養，菌球小片段均勻密布整個培養物，菌絲體干重為1.73 g/100 g發酵物。靜置3 d未見分層，這與其中高質量濃度多糖和果膠關系密切，其中果膠便具有穩定、膠凝、乳化等特性[13]。

2.2 酒精發酵

合并搖床培養物加糖膠磨后，雖未經消毒處理，但主發酵期72 h內，可明顯觀察到發酵液處于翻滾狀態，液面無任何異常氣泡產生，也未聞到任何異常氣味，說明酒精發酵非常順暢。

2.3 百云6號菌絲體發酵原酒分析

2.3.1 感官指標

色澤：黃褐色、均勻一致；狀態：鮮亮、透明、有光澤，無雜質、無沉淀；香氣：具有菌絲體特有的淡淡清香和典型陳年黃酒氣味；滋味：口感醇正、自然，但甜味不足、酸味有些突出；酒體：色香味基本協調，味感稍有寡淡，柔和、醇厚性稍有欠缺。

2.3.2 理化指標

菌絲體發酵原酒各項理化指標的檢測結果見表1。云耳百云6號菌絲液體深層培養物發酵原酒（下文稱“云耳菌絲發酵原酒”）除含有正常發酵酒具有的酒精、糖、酸、酯外，還含有豐富的蛋白質，達490 mg/100 mL，以及多糖、果膠、黃酮等生物活性物質，其中多糖、果膠質量濃度分別達到123.2和18.2 mg/100 mL；此外，還含有鈣、鐵、鋅礦物質元素及B族維生素。說明，該發酵酒不但營養價值較高，并且具有一定的保健功能。

表1 云耳百云6號菌絲液體深層培養物發酵原酒理化成分分析結果

2.3.3 氨基酸質量濃度

食物蛋白質營養價值的高低，主要取決于所含必需氨基酸的種類、數量及組成比例，云耳菌絲發酵原酒富含人體8種必需氨基酸，且組成比例較好，必需氨基酸種類齊全（表2），其EAA/TAA為32.13%，EAA/NEAA達52.69%，比較接近FAO/WHO標準的36%和60%要求[14]。

表2 云耳百云6號菌絲液體深層培養物發酵原酒氨基酸組成分析結果 單位：mg/100 mL

2.3.4 微生物指標

云耳菌絲發酵原酒中細菌菌落總數5 CFU/mL；大腸菌群＜0.03 MPN/mL，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均未檢出。檢測結果符合食品安全國家標準 GB 2758—2012《發酵酒及其配制酒》中微生物的限量要求。

2.4 配制

基于發酵原酒存在的一些缺點，特以廣西本土生產的純正蜂蜜進行調配和品評，結果如表3所示。云耳菌絲發酵原酒以添加5%的純正蜂蜜為最佳方案。經配入5%純正蜂蜜后，不但使酒體更加豐滿協調、入口更加綿柔、適口性更好、酒香清香蜜香俱佳，為該發酵酒賦予了更多的營養保健成分，不失為一款優良的發酵酒。

表3 云耳百云6號菌絲液體深層培養物發酵原酒添加純正蜂蜜后酒體評價結果

3 結論和討論

以優化的液體培養基進行百云6號菌絲深層發酵，獲得漿糊狀、均勻一致、不分層、布滿菌絲小片段的培養物，經加糖膠磨，添加酒精酵母發酵過濾后，獲得酒精度為10.3%vol的發酵原酒，經檢測各項指標均符合國家標準。其總糖、總酸、總酯質量濃度分別為146，620和69 mg/100 mL，還含有豐富的營養和生物活性物質，其中碳水化合物、蛋白質、總氨基酸、多糖、果膠質量濃度分別為890，490，305，123.2和18.2 mg/100 mL；酒體黃褐色、澄清透明，有光澤，無沉淀物和懸浮物，具有菌絲特有清香及陳黃酒酒香，無不良雜味，但口感味道稍寡淡。配入5%純正蜂蜜后，不但使酒體更加豐滿協調、入口更加綿柔、適口性更好、酒香清香蜜香俱佳，更為該發酵酒賦予了更多的營養保健成分。研究認為，菌多糖、果膠、黃酮都是具有生理活性的物質[15-17]；蜂蜜的營養成分非常復雜，主要成分是糖類，還有氨基酸、維生素、有機酸、生物酶等，具有保護胃腸道、抑菌消炎、抗氧化、保護心血管等作用[17-18]。

食藥用真菌在深層培養過程中會產生多糖、多肽、黃酮、生物堿、萜類化合物、甾醇、苷類、酚類、酶、核酸、氨基酸、維生素、具抗生素作用的多種化合物及植物激素等多種生理活性物質，這些物質分別具有對心血管、肝臟、神經系統、腎、性等人體器官的防病治病作用以及抗癌、消炎、抗衰老、抗菌、抗潰瘍等功效[19-21]。以百云6號深層發酵培養物為原料，調配后，未經消毒處理，開放式接種酒精酵母能夠順暢進行酒精發酵，這應與其中所含多糖、果膠、黃酮等活性物質具有抗菌作用有直接關系。鄧慶華等[22]考察了黑木耳多糖對霉菌、細菌的抑制活性，結果顯示黑木耳多糖對細菌的抑制作用更為明顯。

綜上所述，以云耳百云6號菌絲液體深層培養物為原料，完全可以釀造出一款色、香、體、味俱佳，營養保健具有的優良發酵酒。發酵酒的研制，最大限度的保留了云耳菌絲液體深層發酵物的營養及活性成分，并且省卻了菌絲體提取工序，簡化了工藝程序。