高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒奶粉中7種水溶性維生素

張麗芳，張?chǎng)危荟危瑥埩⑻?/p>

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（唐山 063000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）

維生素是維持人體正常生理功能的一類(lèi)微量有機(jī)物質(zhì)，分為脂溶性和水溶性?xún)纱箢?lèi)。水溶性維生素主要有B族維生素和維生素C（VC），B族維生素包括：維生素B1（VB1）、維生素B2（VB2）、煙酸、泛酸、葉酸、生物素、維生素B6（VB6）和維生素B12（VB12）。它們是嬰兒奶粉的重要組成部分，在人體生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。現(xiàn)行國(guó)標(biāo)對(duì)水溶性維生素的檢測(cè)方法主要以單一維生素為主[1-6]，方法有微生物法和液相色譜法。微生物法檢測(cè)周期長(zhǎng)、重復(fù)性差，偶然因素較多，不能同時(shí)檢測(cè)多種維生素。文獻(xiàn)報(bào)道多種維生素同時(shí)測(cè)定的方法，主要有液相色譜法[7-9]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-14]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏性高、專(zhuān)一強(qiáng)等特點(diǎn)，但價(jià)格昂貴，儀器維護(hù)復(fù)雜，在基層實(shí)驗(yàn)室比較難普及。高效液相色譜也具有較好的靈敏度和特異性，價(jià)格適中，分析成本低，適合在實(shí)驗(yàn)室中廣泛推廣。

維生素物質(zhì)間性質(zhì)差異較大，而奶粉的基質(zhì)又復(fù)雜，給維生素的同時(shí)測(cè)定帶來(lái)難度。劉娜等[8]通過(guò)在流動(dòng)相中添加七氟丁酸，延長(zhǎng)保留時(shí)間，提高分離度，建立嬰兒配方奶粉中8種水溶性維生素的高效液相色譜法，但方法中七氟丁酸的使用對(duì)環(huán)境存在危害。其他報(bào)道多以4～6種水溶性維生素同時(shí)測(cè)定較多。試驗(yàn)以庚烷磺酸鈉代替七氟丁酸，優(yōu)化色譜條件，建立嬰幼兒奶粉中7種水溶性維生素的高效液相色譜法，并對(duì)10批嬰幼兒配方奶粉中的水溶性維生素進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)方法驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，線(xiàn)性范圍寬，提高了檢測(cè)效率，可為監(jiān)督部門(mén)的日常檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀（配SPD-M20A二級(jí)陣列管檢測(cè)器，島津）；酸度計(jì)（PHS-3E，雷磁儀電科學(xué)儀器）；電子天平（PL2002，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲儀（KQ-800KDB昆山市超聲儀器有限公司）。

VB1（100390-201806，含量97.9%），VB2（100369-201905，含量98.2%），煙酸（100434-201603，含量99.8%），煙酰胺（100115-202005，含量99.9%），葉酸（100074-201715，含量89.3%），VB6（100116-201906，含量99.9%），VC（100425-201508，含量100%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鹽酸、氫氧化鈉、庚烷磺酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、醋酸、三乙胺（均為分析純，天津褔晨化學(xué)試劑廠）；甲醇（色譜純，德國(guó)merk）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取適量的煙酸、煙酰胺和VB6標(biāo)準(zhǔn)品，分別用純化水配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱(chēng)取適量的VB1標(biāo)準(zhǔn)品用濃度0.01 mol/L的鹽酸溶解后，用純化水制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱(chēng)取適量的VB2標(biāo)準(zhǔn)品，用濃度2 mol/mL的鹽酸溶液溶解后，用純化水制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱(chēng)取適量的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用適量水潤(rùn)濕，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%氨水溶液至完全溶解，用純化水制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱(chēng)取VC標(biāo)準(zhǔn)品適量，用純化水制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。配制過(guò)程避光，儲(chǔ)備液置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。標(biāo)準(zhǔn)工作液在檢測(cè)前由儲(chǔ)備液用純化水配制成不同濃度。

1.2.2 樣品的制備

稱(chēng)取待測(cè)樣品5.0 g（精確到0.01 g）于50 mL燒杯中，加入25 mL 50 ℃的溫水，混合均勻，超聲10 min，靜置放冷置室溫。然后用5 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至1.7，放置2 min后，用2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)試樣溶液pH至4.5，混勻，用水定容至50 mL。以8 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)0.2 μm濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱WondaSilTMC18（150 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A：庚烷磺酸鈉1.1 g，醋酸25 mL，乙二胺四乙酸二鈉50 mg；三乙胺5 mL，用800 mL水溶解，調(diào)節(jié)pH至3.5，定容至1 000 mL。流動(dòng)相B采用甲醇。流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B= 85∶15。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

由于水溶性維生素屬于極性化合物，在反相色譜柱上保留比較弱，因此添加庚烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑，使水溶性維生素形成中性離子對(duì)，延長(zhǎng)待測(cè)目標(biāo)物的保留時(shí)間，增加分離度。嬰兒配方奶粉中多添加大量金屬元素，對(duì)色譜柱和色譜峰形都有影響，所以流動(dòng)相中添加EDTA，降低影響。張憬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，水溶性維生素檢測(cè)的流動(dòng)相中三乙胺的添加可對(duì)峰形起到改善作用，經(jīng)考察0.5%的三乙胺添加效果最好，與已報(bào)道的結(jié)果一致。

2.1.2 流動(dòng)相pH的選擇

調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH可以抑制維生素的電離，調(diào)節(jié)保留時(shí)間，控制分離度。B族維生素在酸性條件性比較穩(wěn)定，所以選擇pH 4.0，3.5和3.0這3種情況下進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果pH 3.5和3.0時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分離效果較好，但在pH 3.0時(shí)基質(zhì)存在干擾，所以選擇pH 3.5。

2.1.3 流動(dòng)相配比的選擇

比較甲醇的體積分?jǐn)?shù)分別為20%，15%和10%時(shí)的分離效果，甲醇體積分?jǐn)?shù)20%時(shí)，出峰時(shí)間較快，VC和煙酸不能完全分離；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為10%，維生素VB2的保留時(shí)間太長(zhǎng)，甲醇體積分?jǐn)?shù)15%時(shí)，各目標(biāo)物在25 min內(nèi)完全分離，且干擾小，最終確定甲醇的體積分?jǐn)?shù)為15%。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)

將7種水溶性維生素分別在190～700 nm作紫外光譜掃描，得到各物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)：VC、VB1、煙酸、煙酰胺為260 nm，VB2為267 nm，葉酸為281 nm、VB6為290 nm，利用二級(jí)陣列管檢測(cè)器，設(shè)定VC、VB1、VB2、煙酸、煙酰胺檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，葉酸、VB6檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

優(yōu)化后的色譜條件如1.2.3所示。在優(yōu)化的色譜條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。7種可溶性維生素分離情況較好。VC、煙酸、煙酰胺、VB6、葉酸、VB1和VB2的出峰時(shí)間分別為3.017，3.901，5.358，6.981，11.519，14.407和23.078。

圖1 色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件選擇

根據(jù)水溶性維生素的化學(xué)性質(zhì)，采用50 ℃水溶解乳粉，超聲提取10 min，利用等電點(diǎn)沉淀法去除樣品中的蛋白質(zhì)，樣品中加鹽酸溶解調(diào)節(jié)pH至1.7，放置2 min，再用氫氧化鈉溶解調(diào)節(jié)至pH 4.5。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，此前處理過(guò)程回收率高，可滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

2.3 線(xiàn)性范圍及檢出限

嬰幼兒奶粉中不同水溶性維生素的含量差異較大，根據(jù)嬰幼兒奶粉中各種水溶性維生素的大致濃度范圍，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的范圍。以3倍基線(xiàn)噪聲所對(duì)應(yīng)的維生素濃度計(jì)算各種維生素的檢出限。結(jié)果表明，VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、VB6在0.1～10 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)；葉酸在0.05～5 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)；VC在1～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，均具有很好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸系數(shù)r在0.999 60～0.999 90。除葉酸外，檢出限均達(dá)到或優(yōu)于國(guó)家水平。7種水溶性維生素的線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限，見(jiàn)表1。

表1 維生素的線(xiàn)性方程和檢出限

葉酸的國(guó)標(biāo)檢出限為0.001 mg/100 g，檢測(cè)方法為微生物方法，操作繁雜，對(duì)菌種活力、培養(yǎng)條件、人員操作水平等要求嚴(yán)格，檢測(cè)周期長(zhǎng)，結(jié)果存在20%的不確定度[16]。該方法的檢出限雖高于國(guó)標(biāo)要求，但可滿(mǎn)足嬰幼兒奶粉中國(guó)標(biāo)限量的檢測(cè)要求，方法簡(jiǎn)單，更適合推廣。

2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差

向已知濃度的奶粉樣品中分別添加3種濃度的各種水溶性維生素，每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)6次，通過(guò)加標(biāo)回收的方式考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。加標(biāo)回收率為94%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD（n=6）為0.3%～2.1%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、可靠，滿(mǎn)足定量分析的要求。

表2 奶粉中7種水溶性維生素在3個(gè)不同水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用該方法對(duì)10批市售嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素的含量進(jìn)行測(cè)定，實(shí)測(cè)值、標(biāo)示值以及實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值的比值，見(jiàn)表3。維生素實(shí)際測(cè)定含量均符合GB 10765—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》[17]和GB 10767—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 較大嬰兒和幼兒配方奶粉》[18]。實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值比較，比值均大于80%，符合GB 13432—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝特殊膳食用食品標(biāo)簽》[19]。

表3 實(shí)際樣品中水溶性維生素實(shí)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)值的比對(duì)

接表3

3 結(jié)論

建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、VB6、葉酸和VC的檢測(cè)方法。該方法的分析時(shí)間為25 min，線(xiàn)性關(guān)系良好（r＞0.999），檢出限在0.008～0.024 mg/100 g，3個(gè)水平添加回收率在94%～105%，SRSD為0.3%～2.1%。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，可用于嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素含量的同步測(cè)定。