發酵乳中37種抗生素快速篩選檢測方法的優化

張彤，胡姝，畢孝瑞，李曉東，徐宜宏*，王秋艷

1. 沈陽海關技術中心（沈陽 110016）；2. 大連海關技術中心（大連 116000）

發酵乳因為其獨特的口感和較高的營養價值，受到世界各地的喜愛[1-3]。發酵乳作為世界性的產業發展迅速[4-6]。在奶牛的飼養過程中飼養員會通過在飼料中添加一些抗生素預防和治療疾病，但是大劑量抗生素的使用會造成牛奶中藥物殘留，從而給人體健康帶來危害[7-10]。由于部分的養殖企業并不按照安全標準使用這些抗生素，造成我國發酵乳中抗生素含量逐年上升，如果長期食用這種發酵乳會對人體造成很大傷害[11-13]。特別是殘留在發酵乳中的抗生素，很難降解，而發酵乳作為嬰幼兒食品的一種，長期食用可能會嚴重破壞嬰幼兒的免疫系統[14]。

目前應用最廣的快篩檢測方法就是QuEChERS方法，多用于植物源性食品中農殘的檢測，獸藥殘留的檢測相對較少且普遍性較低[15-18]。應用到發酵乳方面的檢測更是相對較少且一般均為牛奶的檢測，而且檢測的抗生素種類沒有特別的全面[19-20]。試驗通過優化現有的QuEChERS前處理方法，建立發酵乳中37種常用抗生素殘留的快速篩查檢測方法，以期為發酵乳的安全保障提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

從沈陽市各超市中隨機采購不同廠家生產的不同種類的發酵乳樣品30份，每份樣品采購2個相同批號的獨立包裝，每個樣品至少0.2 L。

1.1.2 試驗儀器

LC-20A/AB6500超高效液相色譜串聯質譜儀（日本島津公司/美國AB公司）；X1R離心機（德國Thermo公司）；渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；CPA225D電子分析天平（德國Sartorius公司）；Biocel超純水機（美國Millipore公司）；EVAP 111氮吹濃縮儀（美國Organomation公司）。

1.1.3 試劑及標準溶液

甲醇、乙腈（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；甲酸、無水硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；C18、NH2、PSA、PAX（北京迪馬科技有限公司）；氯四環素、沙拉沙星、達氟沙星、洛美沙星、強力霉素、土霉素、螺旋霉素、交沙霉素、依諾沙星、四環素、羅紅霉素、林可霉素、北里霉素、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶、克林霉素、紅霉素、替米考星、磺胺吡唑、泰樂菌素、司帕沙星、磺胺醋酰磺胺索嘧啶、奧比沙星、吡哌酸、磺胺-5-甲氧嘧啶、西諾沙星、磺胺甲惡唑、培氟哌酸、米洛沙星、氟甲喹、地美硝唑、氟羅沙星、麻保沙星、甲硝唑、二氟沙星、洛硝噠唑地標準品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；試驗所用水均為一級水。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的提取與凈化

稱取2.0 g試樣于離心管內，加9.9 mL入乙腈、0.1 mL甲酸及0.1 g乙二胺四乙酸二鈉，振蕩1 min，加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋混勻，超聲提取15 min，按6 000 r/min離心6 min，取6 mL上清液，加入0.9 g無水硫酸鈉和150 mg C18吸附劑，渦混2 min，按6 000 r/min 離心6 min，靜置10 min，取3 mL上清液 于10 mL試管中在40 ℃下氮吹濃縮至干。加入1 mL 0.1%甲酸-乙腈（9∶1，V/V）的定容液，渦旋混勻后，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS/MS測定。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC @BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品室溫度為室溫；進樣體積5.0 μL；流速0.2 mL/min；流動相為甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～2 min，95% B；2～8 min，95%～75% B；8～14 min，75%～58% B；14～30 min，58%～5% B；30～32 min，5% B；32～35 min，5%～95% B。

1.2.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V；入口電壓10 V；霧化氣50 Psi；輔助加熱氣50 Psi；氣簾氣30 Psi；監測模式采用多反應離子監測（multiple reaction monitoring，MRM），具體參數見表1。

表1 待測抗生素的質譜參數

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

選取37種抗生素中選擇具有代表性的四環素、磺胺甲惡唑、克林霉素、交沙霉素、依諾沙星、洛美沙星進行前處理優化。

2.1.1 提取液的選擇優化

分別用乙腈、1%甲酸-乙腈、乙二胺四乙酸二鈉-1%甲酸乙腈作為提取液測定回收率，結果見圖1。

由圖1可知，提取液溶劑的選擇對四環素的影響較大，因為其易與發酵乳中的鈣、鎂離子發生螯合反應形成難以溶解的鹽類，所以在提取液中加入乙二胺四乙酸二鈉和甲酸后，能夠抑制此類化合物的生成，從而提高四環素回收率，因此，初步選用乙二胺四乙酸二鈉-1%甲酸乙腈作為提取液。

圖1 提取溶劑種類對回收率的影響

2.1.2 吸附劑的確定

分別用C18，NH2，PSA和PAX作為吸附劑，進行前處理，測定回收率。結果見圖2。

由圖2可知，吸附劑的種類對于大多數抗生素回收率的影響也沒有較大區別，但是對于四環素類抗生素的回收率影響區別較大。其中，PSA作為吸附劑時四環素的回收率最低，其他的NH2和PAX對四環素的吸附性也較強，回收率均不及C18，故選用C18作為吸附劑進行凈化。

圖2 不同吸附劑對回收率的影響

2.1.3 吸附劑用量的確定

分別加入50，100，150和200 mg C18吸附劑，測定回收率。結果見圖3。

由圖3可知，隨著吸附劑使用量增加，回收率逐漸升高，但150 mg之后趨于平穩，且由于吸附劑成本較高，因此，確定吸附劑C18用量為150 mg。

圖3 不同吸附劑用量對回收率的影響

2.2 方法學驗證

用優化后的前處理方法對陰性空白基質進行前處理，得到基質配制不同濃度的混合工作曲線，可以有效減小基質效應，提高檢測的準確性。由于37種抗生素的靈敏度純在差異，所以選擇不同的線性濃度。37種抗生素在考察范圍內均線性良好，且相關系數均不低于0.99。抗生素的測定低限具體結果見表2。根據測定低限的不同，分別添加測定低限的1，2和10倍制成模擬的加標樣品，所得到的樣品中各待測抗生素的回收率、變異系數見表2。試驗結果表明，在所考察的發酵乳中，37種抗生素的回收率為60.3%～92.8%，變異系數為3.2%～10.8%。

表2 線性回歸方程、檢測低限、回收率及變異系數

接表2

2.3 實際樣品中37種抗生素殘留量的測定

采用建立的方法測定沈陽市售的30份發酵乳樣品中37種抗生素。30份發酵乳樣品中37種抗生素檢測值均小于方法的測定低限。

3 結論與討論

通過單因素試驗確定發酵乳中37種抗生素殘留量的檢測方法。試驗結果表明：該方法準確性和重復性好，靈敏度高，完全滿足發酵乳中常見抗生素殘留檢測需要，同時可推廣到同行業其他實驗室，實現儀器和成果共享，具有一定創新性和可推廣應用的價值。