魚類鮮度K值的HPLC-UV-MS/MS快速測定方法研究

張飛，周漪波，鄧遠強，阮奇珺，付強，鄭家概

廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省保健食品功效成分檢測與風險物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心（廣州 510070）

我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)、消費和貿(mào)易大國，隨著社會經(jīng)濟飛速發(fā)展，消費者對于魚肉的感官、營養(yǎng)價值和安全性的要求日益提高[1]。新鮮度是衡量魚肉及其制品品質(zhì)的重要指標之一，它直接決定產(chǎn)品的最終價值[2]。對于某些生食的魚肉產(chǎn)品，其新鮮度還是品質(zhì)和安全性的重要評價指標。新鮮的魚肉組織細嫩疏松、水分含量較高、內(nèi)源性蛋白酶豐富，即使在保鮮條件下，仍會發(fā)生一系列的變化，如三磷酸腺苷（ATP）降解、脂肪氧化、微生物滋生等[3-6]。活魚死后，呼吸作用停止，ATP停止合成，魚肉細胞中的ATP在酶的催化作用下依次降解為二磷酸腺苷（ADP）、腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、肌苷（HxR）和次黃嘌呤（Hx）[7]。Saito等[8]將ATP降解鏈的末端產(chǎn)物（HxR和Hx）總和與ATP及其降解產(chǎn)物的總和的百分比定義為K值，K值可以量化評估魚肉早期的新鮮度[9]。ATP及其降解產(chǎn)物均為極性化合物，有的化合物結(jié)構(gòu)相似，同時分離比較困難，而且魚肉基質(zhì)復(fù)雜，容易受雜質(zhì)的干擾。目前測定K值的方法有高效液相色譜法、可視化嗅覺技術(shù)-HPLC法、濾紙電泳分析法和生物傳感器法等[10-13]。其中最常用的方法是高效液相色譜法，但是分離耗時較長，ATP等化合物容易分解[14]，而且樣品基質(zhì)復(fù)雜，容易干擾目標物。

針對ATP及其降解產(chǎn)物的不穩(wěn)定性和魚肉基質(zhì)的復(fù)雜性，試驗建立了高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜同時快速測定ATP及其降解產(chǎn)物的分析方法，通過ATP及其降解產(chǎn)物的含量求得K值。將該方法用于魚肉中K值的測定，初步研究了儲存溫度對魚肉鮮度K值的影響規(guī)律，可為保鮮技術(shù)的研究提供數(shù)據(jù)支持，為其他水產(chǎn)品的K值測定提供技術(shù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290Ⅱ/6470A Triple Quard MS超高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent）；BT125D電子天平（德國Sartorius）；?T18 digital ULTRA-TURRAX?均質(zhì)機（德國IKA）；FB15067型超聲波清洗器（美國Fisher brand）；甲醇（色譜純，Honeywell）；氫氧化鉀、鹽酸、高氯酸（分析純，廣州化學試劑廠）；甲酸、乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。此次研究用水均為一級水，試驗所用活魚樣品為市場購買。

三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、肌苷和次黃嘌呤（≥97%，Sigma）。10%高氯酸溶液和5%高氯酸溶液配制后密封，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 標準溶液配制

標準儲備液：稱取適量的ATP、ADP、HxR和IMP，用水溶解，配制成1.0 mg/mL的標準溶液。

稱取適量的AMP和Hx于10 mL容量瓶，加2滴濃鹽酸，用水溶解，配制成1.0 mg/mL的標準溶液。

標準工作液：用水將上述標準儲備液混合并逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為100，80，50，20，10，5.0和1.0 mg/L系列標準工作液。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：乙酸銨溶液（20 mmol/L，0.1%甲酸）；流動相B：乙酸銨溶液（20 mmol/L，0.1%甲酸）/甲醇（1/9，V/V）。梯度洗脫：0～6 min，0% B；6～9 min，0% B～20% B；9～10 min，20% B；10～10.1 min，20% B～0% B；10.1～13 min，0% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長254 nm。

對乙酰氨基酚除了有液體劑型外，還有另外一種劑型——通過肛門給藥的栓劑。在國外，肛門給藥其實很普遍，但我國對于這種方式接受起來還比較困難。但對于有些情況，比如給寶寶喂藥時寶寶會嘔吐，或者夜里發(fā)高燒，不想把寶寶叫醒，這些時候肛門栓劑就會方便很多。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：安捷倫噴射流電噴霧離子源（AJS ESI）；掃描模式：正離子；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣（N2）溫度：350 ℃，流速：7.0 L/min；霧化氣（N2）壓力：40 psi；鞘流氣（N2）溫度：350 ℃，流速：11.0 L/min；毛細管入口端電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V；其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 6種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

預(yù)處理：將魚去頭尾、去鱗、去內(nèi)臟，清洗瀝干，去骨取魚肉切成魚片，粉碎均勻后備用。

前處理：稱取2.0 g（精確至0.1 mg）試樣于50 mL具塞離心管，加入20 mL 10%高氯酸提取劑，以10 000 r/min均質(zhì)1 min，超聲提取5 min，4 ℃下以8 000 r/min離心2 min，取出上清液。再取20 mL 5%高氯酸，清洗均質(zhì)器刀頭，洗液加到殘渣中。重復(fù)上述操作，合并上清液，用水定容。取5 mL上述定容液至10 mL比色管，分別采用3.57 mol/L和1.79 mol/L的氫氧化鉀溶液將其pH調(diào)節(jié)至6.0～6.4，再用水定容至10 mL，過濾備用。注意：均質(zhì)和超聲均在冰水浴下進行。

1.5 K值計算

參照相關(guān)文獻[8，10]按式（1）計算K值，單位為百分率。由式（1）可知K值越小，魚肉新鮮度越好。

式中：XATP，XADP，XAMP，XIMP，XHxR，XHx為樣品中ATP，ADP，AMP，IMP，HxR和Hx的含量，mmol/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由化學結(jié)構(gòu)可知，6種化合物在溶液中均以帶電離子形式存在，因此適用于電噴霧離子源進行離子化。在電噴霧離子源的正、負離子模式下，分別對6種化合物標準溶液進行質(zhì)譜掃描分析，結(jié)果表明在正離子模式下響應(yīng)較好，信噪比較高，因此選擇正離子模式進行測定，并同時確定了6種化合物的母離子質(zhì)荷比。通過碎片離子掃描分析，選擇豐度相對較高且穩(wěn)定的碎片離子為定性子離子。最后通過多反應(yīng)監(jiān)測模式優(yōu)化各項質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜模式的選擇

2.2.2 色譜柱的選擇

分別選用4種尺寸的C18柱進行分離比對[17]：A柱Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm ×100 mm，2.7 μm）；B柱Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm ×150 mm，2.7 μm）；C柱Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；D柱Ultimate AQ-C18（2.1 mm ×150 mm，3.0 μm）。在同等流動相條件下，B和D柱不能實現(xiàn)IMP，AMP和Hx的良好分離；A柱可實現(xiàn)6種化合物的分離，但色譜峰形較寬，拖尾嚴重；C柱既可實現(xiàn)基線分離，又可使色譜峰形良好，因此選擇C柱。

2.2.3 流動相的選擇

在正離子模式下，流動相中添加揮發(fā)性有機酸可以提高化合物的電離效率，增加質(zhì)譜響應(yīng)值，試驗流動相選擇添加甲酸[17]。在反相色譜中，常用的有機相為乙腈或甲醇。選擇乙腈，在梯度洗脫時產(chǎn)生的梯度鬼峰較多，因此選定甲醇作為有機相。

流動相中甲酸和乙酸銨濃度的高低對6種化合物的保留時間和色譜峰形均有影響。通過考察不同甲酸和乙酸銨的濃度，最終確定了最佳流動相條件：流動相A含0.1%甲酸的20 mmol/L乙酸銨溶液；流動相B含0.1%甲酸的20 mmol/L乙酸銨溶液/甲醇（1/9，V/V）。通過進一步優(yōu)化梯度洗脫程序，6種化合物在13 min內(nèi)可實現(xiàn)良好分離，得到的色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液的總離子流和紫外色譜圖

2.3 樣品前處理

參考相關(guān)標準方法進行前處理優(yōu)化[10]。稱取預(yù)處理后的樣品，先進行高速均質(zhì)，可以快速破壞魚肉細胞和組織，制得勻漿液，再利用超聲提取法充分提取目標物。提取劑選用高氯酸溶液，既可以有效提取目標物，又可以沉淀蛋白質(zhì)等化合物，減少基質(zhì)干擾。提取液的pH會影響ATP和ADP色譜峰形和保留時間，因此，需要調(diào)節(jié)提取液pH。提取的全過程保持低溫，以減緩ATD和ADP等化合物的降解。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的色譜條件下，對7個水平的系列標準工作液進行測定。以6種化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，紫外色譜峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。結(jié)果表明，ATP和ADP在5.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其他4種在1.0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。當取樣量2.0 g，定容體積50 mL，稀釋一倍時，以3倍和10倍信噪比（S/N）分別計算方法的檢出限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 6種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 準確度和精密度

試驗選擇石斑魚進行測定，前處理方法參照1.4小節(jié)，ATP、Hx、AMP和HxR添加質(zhì)量分數(shù)為60～180 mg/kg時，回收率為71%～112%；ADP添加質(zhì)量分數(shù)為120～200 mg/kg時，回收率為73%～109%；IMP添加質(zhì)量分數(shù)為1 200～2 000 mg/kg時，回收率為81%～107%。方法的準確度可滿足試驗要求。

平行制備6份供試品溶液，測定供試品溶液中6種化合物的含量，計算求得6種化合物的相對標準偏差（SRSD），結(jié)果為8.5%～14.5%。

2.6 實際樣品測定

采用該方法對石斑魚和紅魚的鮮度K值進行測定，并探討在不同溫度下貯藏，魚肉的鮮度K值變化情況。得到的K值的變化規(guī)律見圖2。

由圖2可知：隨著貯藏時間的延長，兩種魚的K值均呈上升趨勢；貯藏溫度越高，兩種魚的K值上升速度越快；6 d后，（-2～2）℃冰晶溫度下貯藏的魚肉K值最高；魚的種類不同，初始K值不同，K值變化的快慢也不同。

圖2 -2～2 ℃，0 ℃和-18 ℃條件下K值變化

3 結(jié)論

試驗建立了低溫提取-高效液相色譜-紫外-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜快速測定魚類鮮度K值的分析方法。與現(xiàn)有方法相比[10]，該方法的色譜條件良好、分析時間短、回收率較高，質(zhì)譜條件可降低基質(zhì)干擾、定性準確。該方法適用于魚肉中ATP及其降解產(chǎn)物的快速準確定性和定量分析。試驗存在不足之處：ATP和ADP色譜峰拖尾，引起信噪比降低，導(dǎo)致二者檢出限較高。ATP和ADP色譜峰拖尾的原因有：（1）二者均含有堿性氨基，易與固定相殘余的硅羥基發(fā)生作用；（2）儀器中的鋼組件表面涂有金屬氧化物，然而這些金屬氧化物的活性位點易與活性分子相結(jié)合。磷酸緩沖液流動相可有效降低上述兩種作用力，然而磷酸鹽是不揮發(fā)鹽，不能用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。此外，質(zhì)譜分析只能用于定性，因為ATP和ADP等化合物在質(zhì)譜電離過程中就會發(fā)生部分分解，因此采用質(zhì)譜定量不準確。