UPLC-Q-TOF-MS法篩查牛乳中48種獸藥殘留

康俊杰，鄭百芹，項愛麗，李愛軍，董李學(xué)，湯學(xué)英

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心（唐山 063000）

原料奶的安全問題，作為生產(chǎn)鏈的源頭面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，其主要表現(xiàn)是生鮮牛乳中的獸藥殘留。人類長期進食獸殘超標(biāo)的牛乳，會對身體造成不良影響，同時還會造成人體的耐藥性[1-4]。β-受體激動劑一直以來是豬肉中檢測的重點參數(shù)，但近兩年在唐山地區(qū)牛肉和牛尿中克倫特羅有檢出的現(xiàn)象。GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》和《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號》對獸藥殘留也做出了規(guī)定，考慮到養(yǎng)殖者用藥的不確定性和復(fù)雜性，建立一種包括β-受體激動劑的快速測定多種獸殘的檢測方法刻不容緩。

目前，牛乳中多種獸藥的快速檢測方法有微生物法[5]、毛細管電泳法[6]、酶聯(lián)免疫吸附法[7-8]、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS法）[11-14]。針對以上問題，試驗采用UPLC-Q-TOF-MS快速篩查生鮮牛乳中48種磺胺類、喹諾酮類、β-受體激動劑類、抗病毒類4類獸藥殘留，該方法具有前處理快速、靈敏度高、回收率穩(wěn)定等優(yōu)點，可用于牛奶樣品中目標(biāo)獸藥的測定，為牛奶的快速篩查提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

X500R超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（美國SCIEX公司）；高速冷凍離心機（湖南cence湘儀產(chǎn)品）。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜純，美國Merck公司）；甲酸銨（色譜純，美國Sigma公司）；Oasis HLB、Oasis PRIME HLB固相萃取柱（美國Waters公司）；十八烷基硅烷（ODS C18，美國Agilent公司）；試驗用水為超純水（Millipore公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、周效磺胺、磺胺二甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺二甲異唑、苯甲酰磺胺、磺胺喹惡啉、磺胺醋酰、甲氧芐啶、磺胺苯吡唑、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、鹽酸地氟沙星、惡唑酸、氟甲喹、沙拉沙星、司帕沙星、丹諾沙星、氟羅沙星、馬波沙星、依諾沙星、奧比沙星、甲磺酸培氟沙星、洛美沙星、西諾沙星、萘啶酸、金剛烷胺、鹽酸金剛乙胺、鹽酸美金剛、咪喹莫特、鹽酸嗎啉胍（病毒靈）、奧司他韋、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅、氯丙那林、特布他林，純度均≥98%，天津阿爾塔公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別吸取1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃保存。試驗用1∶1甲醇水稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，于4 ℃保存。

1.3 樣品預(yù)處理

取1.00 g生鮮牛乳，加入4 mL 0.2%甲酸乙腈，旋渦振蕩1 min，按10 000 r/min高速離心5 min，取上清液過Oasis PRIME HLB固相萃取柱。控制流速在1 s/滴，收集全部流出液，氮氣下吹干，用1 mL 5%甲醇水溶液定容，過0.22 μm濾膜后，上機測定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3（21 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流速0.300 mL/min；流動相A為水相體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水，流動相B為有機相10 mmol/L甲酸銨-甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，A為95%；0.5～1.00 min，A由95%線性降至70%；1.00～6.00 min，A由70%線性降至5%；再回到初始狀態(tài)保持3 min。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子模式（ESI+），掃描范圍為m/z80～1 000 Da，毛細管電壓5.5 kV；鞘氣壓力50 psi，氣簾氣35，溫度500 ℃，輔助氣壓力50 psi，CAD氣7；去簇電壓80 V，碰撞能量10 V；為了保障質(zhì)量數(shù)精度，用SEIEX公司提供ESI+溶液，對儀器質(zhì)量軸進行質(zhì)量校正，參比離子為m/z132.904 88，m/z266.159 81，m/z354.212 24和m/z442.264 67。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

試驗選用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，考察了10 mmol/L甲酸銨-甲醇、10 mmol/L甲酸銨-乙腈、0.1%甲酸水、1%甲酸水、乙腈和甲醇6種流動相對48種獸藥的分離、離子化效率和峰型的影響。結(jié)果表明：當(dāng)流動相不加酸或酸度較高時，目標(biāo)化合物的響應(yīng)值均偏小；當(dāng)選用0.1%甲酸水時，目標(biāo)化合物的峰分離較好，響應(yīng)值增大，峰形好；而不加10 mmol/L甲酸銨的甲醇或乙腈的色譜峰明顯提前，分離效果較差。與乙腈相比，甲醇作為流動相可以獲得更好的分離度，所以試驗水相采用0.1%甲酸水，有機相采用10 mmol/L甲酸銨-甲醇作為流動相進行梯度洗脫，以實現(xiàn)目標(biāo)化合物的有效分離。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)國內(nèi)近3年在牛肉、牛尿和牛奶樣品中獸藥殘留的檢出情況，最終確定48種常用獸藥。將目標(biāo)化合物配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。應(yīng)用超高效液相色譜儀進行色譜分離，Q-TOF進行質(zhì)譜信息采集，在ESI+模式下，在m/z80～1 000范圍內(nèi)作一級質(zhì)譜全掃描分析，再在不同的碰撞電壓下，進行二級質(zhì)譜掃描分析，收集48種目標(biāo)化合物的保留時間、母離子精確分子質(zhì)量等信息，以建立完整的48種獸藥的質(zhì)譜篩查譜庫。譜庫中應(yīng)包含化合物的名稱、保留時間等，具體分析參數(shù)見表1。試驗再通過比較各化合物的離子色譜峰的響應(yīng)值和分離度，分別優(yōu)化毛細管電壓、鞘氣壓力等質(zhì)譜參數(shù)，48種獸藥的提取離子色譜圖見圖1，以磺胺噻唑為例，其一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖2和圖3。

圖1 48種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖（正離子）

圖3 磺胺噻唑質(zhì)譜掃描圖

表1 48種獸藥的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 樣品前處理方法的選擇

試驗比較不同提取溶劑，提取目標(biāo)化合物，同時沉淀蛋白。試驗選擇體積分?jǐn)?shù)1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、乙腈作為3種提取液。試驗表明當(dāng)采用0.2%甲酸乙腈提取效果最好，酸化后乙腈的提取效果明顯高于純乙腈，但甲酸的體積分?jǐn)?shù)太高，對堿性化合物回收率影響較大。因此試驗最終選擇0.2%甲酸乙腈作為提取溶劑，與文獻[15]研究結(jié)果一致。48種獸藥化合物的回收率均在60%～120%之間，能滿足快速篩查試驗的基本要求。

試驗選取了Oasis PRIME HLB、Oasis HLB和C18這3種固相萃取柱進行比較試驗。結(jié)果表明，與Oasis HLB和C18相比，Oasis PRIME HLB固相萃取柱能有效去除基質(zhì)干擾，基質(zhì)抑制改善明顯，目標(biāo)化合物均有較高的回收率。同時試驗了Oasis PRIME HLB柱無活化和平衡過程，采用直接上樣品凈化方式，對目標(biāo)化合物進行處理，結(jié)果表明，此固相萃取柱活化平衡步驟對此次試驗的化合物回收率影響不大，故選用Oasis PRIME HLB小柱進行凈化，以達到樣品中目標(biāo)化合物快速篩查的目的。

2.4 方法學(xué)確證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

取空白生鮮牛乳樣品，根據(jù)目標(biāo)化合物在質(zhì)譜中響應(yīng)的強弱，加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗方法進行樣品的預(yù)處理，對提取液中的目標(biāo)化合物進行測定，以化合物的離子峰面積Y對其相應(yīng)質(zhì)量濃度X（μg/kg）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，48種獸藥的線性范圍等見表2。各目標(biāo)化合物的信噪比為10（S/N=10）的濃度，為其定量限（LOQ）。由圖2可看出，在10～500 μg/kg線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.99。查看牛奶中最大殘留限量（MRL）數(shù)值，該方法的LOQ數(shù)值小于MRL，能滿足快速篩查的試驗要求。

圖2 磺胺噻唑提取離子色譜圖

2.4.2 回收率和精密度

向空白牛乳中添加3個不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平（10，20和50 μg/kg）的48種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3小節(jié)的方法進行提取，用UPLC-Q-TOF進行測定目標(biāo)化合物。每一個添加濃度重復(fù)測定6次進行試驗，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）。牛乳中48種獸藥的加標(biāo)回收率為68.4%～118.2%，SRSD為3.1%～29.8%。

2.5 樣品分析

按試驗方法對唐山地區(qū)奶牛場現(xiàn)場采集到的50批生鮮牛乳樣品進行篩查檢測分析。結(jié)果測出一批牛乳樣品中磺胺間甲氧嘧啶有檢出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.4 μg/kg。為了驗證該結(jié)果，分別采用GB/T 21316—2017和GB/T 22966—2008液相質(zhì)譜法進行驗證，檢測結(jié)果分別為83.9和81.6 μg/kg，3種試驗方法的檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差在允許范圍內(nèi)，進一步確證了該方法對牛乳樣品快速篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

該驗建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜測定生鮮牛乳樣品中48種禁用和限用獸藥殘留的快速篩查方法。該方法前處理過程簡單、快速、通量大、準(zhǔn)確性高。UPLC-Q-TOF質(zhì)譜法在牛乳中獸藥殘留快速篩查檢測方面有明顯優(yōu)勢，可一次分析出數(shù)百種不同目標(biāo)化合物，在獸藥殘留篩查領(lǐng)域有很高研究價值。