氣相色譜三重四極桿質譜測定食品中丙烯酰胺

2022-02-21 01:31:20王川丕孫文閃周敏劉芯成鐘寒輝董葉箐

食品工業 2022年1期

王川丕，孫文閃*，周敏，劉芯成，鐘寒輝，董葉箐

綠城農科檢測技術有限公司（杭州 310051）

2002年瑞典國家食品管理局（Swedish National Food Administration）和斯德哥爾摩大學（Srockholm University）首次報告油炸或焙烤富含淀粉的食品中含有大量丙烯酰胺，德國、瑞典、比利時、中國、日本、美國、英國等的研究人員也發表了類似報道，丙烯酰胺對高溫加熱食品的污染引起國際組織和各國政府的高度關注。進一步研究發現丙烯酰胺主要是食物在加熱處理時（大于100 ℃）其天冬酰胺和還原糖通過美拉德反應而生成，并且隨著加熱時間延長而增加[1]。世界衛生組織（WHO）和聯合國糧農組織（FAO）聯合協商報告中指出丙烯酰胺具有潛在的神經毒性、生殖發育毒性、遺傳毒性和致癌性[2-4]。因此，建立一種簡單快速靈敏的測定食品中丙烯酰胺的測定方法非常重要。

丙烯酰胺的測定方法主要有液質聯用法[5-8]、液相色譜法[9-12]、氣相色譜法[11-13]、氣質聯用法[14-18]。液相色譜法靈敏度低且容易受雜質干擾，需要較高的濃縮倍數和復雜的凈化過程，操作復雜。液質聯用法雖然具有較高的靈敏度，食品基質的復雜性需要前處理進行反復的凈化，操作繁瑣。氣相色譜法、氣質聯用法需要用到溴試劑衍生問題對試驗操作造成較大困擾。試驗建立一種使用溴化鉀、溴酸鉀和硫酸代替溴試劑的衍生方法，衍生后采用吹掃捕集富集后直接進樣，三重四級桿MRM模式測定，同位素內標消除基質效應從而為食品中丙烯酰胺的測定提供一個簡單、高靈敏、準確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

GC-2010 plus氣相色譜儀、TQ8040質譜儀（日本島津公司）；TELEDYNE Tekmar Atomx吹掃捕集儀（美國Tekmar公司）；ST16R高速離心機（美國賽默飛世爾公司）；硫酸（優級純，國藥集團）；溴化鉀、溴酸鉀、硫代硫酸鈉（分析純，北京化工廠）；標準品丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺（純度＞99%，德國Dr Ehrenstofer公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取

稱取1 g±0.001 g樣品（精確到0.001 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入10.0 mg/L13C3-丙烯酰胺內標溶液10.0 μL，加入20.0 mL超純水，以2 500 r/min渦旋混合3 min，超聲提取20 min，以8 000 r/min離心5 min，上清液待衍生。

1.2.1.2 衍生

取上述上清液2.00 mL至15 mL離心管，依次加入0.10 mL 10%硫酸溶液，1.0 mL 4.00 mol/L溴化鉀溶液，0.50 mL 0.10 mol/L溴酸鉀溶液，渦旋混勻，于4 ℃條件衍生45 min后，加入0.80 mL 0.20 mol/L硫代硫酸鈉溶液終止衍生反應，渦旋振蕩至溶液變為無色，將全部衍生液轉移到40 mL吹掃捕集瓶內，用純水定容到刻度混勻，待測定。

1.2.2 吹掃捕集條件

吹掃溫度50 ℃；吹掃流速40 mL/min；吹掃時間10 min；脫附溫度220 ℃；脫附流量300 mL/min；烘烤溫度280 ℃。

1.2.3 色譜條件

DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣，高純氦氣；碰撞氣，高純氬氣，純度≥ 99.999%；柱流量1.0 mL/min。色譜柱程序溫度：65 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至200 ℃，以40 ℃/min的速度升至240 ℃，并保持5 min。

1.2.4 質譜條件

色譜-質譜接口溫度250 ℃；電離方式，EI；離子源溫度250 ℃；檢測器電壓0.99 kV；測定方式，多重反應監測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；掃描時間5～10 min；定性、定量離子對、碰撞能量等參數見表1，其中*為定量離子對。

表1 丙烯酰胺及其內標質譜檢測參數

1.2.5 標準溶液配制

標準溶液配制參考文獻[16]，用中間溶液配制丙烯酰胺標準曲線質量濃度分別為0.050，0.200，1.00，5.00，20.0和50.0 μg/L，內標質量濃度1.00 μg/L，現用現配，分別取2.00 mL進行衍生，衍生過程同1.2.1。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

在（EI）源模式下對丙烯酰胺及其內標衍生物進行一級質譜掃描，找到母離子，對母離子進行二級掃描，根據二級掃描質譜圖，選擇強度最大的2個子離子，設定3～45 eV進行碰撞能量優化，優化后響應最強的離子對作為定量離子對，響應次之的為定性離子對。圖1為優化后的氣相色譜質譜條件采集的丙烯酰胺及其內標衍生物總離子色譜圖。

圖1 丙烯酰胺及其內標衍生物MRM總離子色譜圖

2.2 吹掃捕集條件的優化

2.2.1 吹掃溫度的優化

吹掃的溫度對目標物的富集具有重要的作用，比較吹掃溫度25～70 ℃時，50.0 μg/L丙烯酰胺衍生物的峰面積，結果見圖2。隨著吹掃溫度升高，丙烯酰胺衍生物峰面積增加，達到50 ℃時，丙烯酰胺衍生物的峰面積達到穩定，因此，確定吹掃溫度為50 ℃。

圖2 吹掃溫度對衍生產物峰面積的影響

2.2.2 脫附溫度的優化

脫附溫度同樣會影響目標物的峰面積，比較脫附溫度170～260 ℃對丙烯酰胺衍生物（50.0 μg/L）的峰面積影響，結果見圖3，丙烯酰胺衍生物的峰面積隨著脫附溫度增加而增大，脫附溫度220 ℃時，峰面積最大，超過220 ℃時，峰面積下降，可能原因為丙烯酰胺衍生物2，3-二溴丙烯酰胺在高溫條件下分解[14]，因此，吹掃捕集的脫附溫度定為220 ℃。

圖3 脫附溫度對衍生產物峰面積的影響

2.2.3 硫酸溶液使用量的優化

硫酸溶液的作用是為衍生反應提供合適的pH條件，使衍生反應達到最佳效果，其他保持不變的條件下，比較了添加0.06～0.14 mL 10%硫酸溶液對丙烯酰胺衍生物（50.0 μg/L）峰面積的影響，結果見圖4。10%硫酸溶液體積0.1 mL時，對衍生反應最有利，因此確定硫酸溶液的使用量為0.10 mL。

圖4 硫酸溶液用量對衍生產物峰面積的影響

2.2.4 溴化鉀溶液使用量的優化

溴化鉀溶液主要作為反應的還原劑，作為溴單質生成的來源之一，保持其他不變的條件下，比較了添加0.4～1.4 mL 4.0 mol/L溴化鉀溶液對丙烯酰胺衍生物（50.0 μg/L）峰面積的影響，結果見圖5。4.0 mol/L溴化鉀溶液體積1.0 mL時，衍生反應產物峰面積達到最大，因此，確定溴化鉀溶液的使用量為1.0 mL。

圖5 溴化鉀溶液用量對衍生產物峰面積的影響

2.2.5 溴酸鉀溶液使用量的優化

溴酸鉀溶液主要作為反應的氧化劑，也是溴單質生成的來源之一，其他保持不變的條件下，比較了添加0.2～0.7 mL 0.2 mol/L溴酸鉀溶液對丙烯酰胺衍生物（50 μg/L）峰面積的影響，結果見圖6。溴酸鉀溶液0.5 mL時，衍生反應產物峰面積達到最大值，因此確定溴酸鉀溶液體積為0.5 mL。

圖6 溴酸鉀用量對衍生產物峰面積的影響

2.2.6 衍生反應時間的優化

衍生反應時間對衍生效果有一定影響，衍生試劑量確定后，比較4 ℃條件下，反應時間20～65 min對丙烯酰胺衍生物峰面積的影響，結果見圖7。衍生反應時間45 min時，衍生反應產物（50.0 μg/L）峰面積達到穩定，因此，衍生反應時間為45 min。

圖7 反應時間對衍生產物峰面積的影響

2.3 方法的檢出限、定量限、線性范圍

檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）的確定通過樣品加標回收，進樣分析為3倍信噪比和10倍信噪比，得到分別為0.300和1.00 μg/kg。在1.2.2，1.2.3和1.2.4儀器條件下進樣分析，丙烯酰胺的衍生產物在1.00～1.00×103μg/kg范圍內的有好的線性關系，線性方程為y=1.36x-0.212，相關系數R2=0.999。

2.4 方法的準確度與精密度

方法的準確度通過回收率來考察，精密度通過同一濃度平行添加6次回收率的相對標準偏差（SRSD）獲得，添加質量分數分別為定量限1.00 μg/kg，10倍定量限10.0 μg/kg，線性范圍最高點對應的樣品濃度1.00×103μg/kg。加標樣品選擇為餅干、薯條、油炸方便面、面包四種常見油炸或焙烤富含淀粉的食品，回收率和相對標準偏差（SRSD）的結果見表2。丙烯酰胺在四種基質中的回收率（79.2%～92.6%）和精密度（5.17%～9.15%）符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范基本信息食品理化檢測》的要求。