MicroRNA-590在急性心肌梗死診斷及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值

儲(chǔ)時(shí)春 成 威

心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是全球發(fā)病、致殘和死亡人數(shù)最多的疾病，急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是冠心病中最致命的病癥。AMI的特征是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、潰瘍、裂縫或糜爛，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血栓，引起心肌血流量減少和/或遠(yuǎn)端栓塞以及隨后的心肌壞死[1]。及時(shí)、正確的診斷以及早期再灌注是影響AMI預(yù)后和臨床結(jié)局的主要因素[2]。隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)、藥物溶栓治療等治療手段的廣泛應(yīng)用，AMI患者的生存率明顯改善，但仍有一部分患者發(fā)生心肌再灌注延遲或失敗、心力衰竭、惡性心律失常、心肌再梗死等主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular event, MACE)。因此，盡早識(shí)別、及時(shí)評(píng)估預(yù)后對(duì)降低AMI患者病死率有重要作用。研究[3]發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中miRNAs具有顯著的穩(wěn)定性，可用于心血管疾病的診斷、療效和預(yù)后評(píng)估。近年來，細(xì)胞和動(dòng)物研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，miR-590具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制單核巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及炎性細(xì)胞因子分泌，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展。本研究擬檢測(cè)miR-590在AMI患者外周血中的表達(dá)，分析其在AMI診斷及預(yù)后評(píng)估方面的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年5月至2019年10月安徽省第二人民醫(yī)院心內(nèi)科收治并行冠狀動(dòng)脈造影(coronary angiography, CAG)的162例患者為研究對(duì)象，男性94例，女性68例；年齡40～93歲，平均(63.93±12.07)歲。根據(jù)臨床診斷及CAG結(jié)果，將40例冠脈正?；颊咦鳛閷?duì)照組(HC組)，50例穩(wěn)定型心絞痛患者作為SAP組，72例AMI患者作為AMI組。AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2012年歐洲心臟病學(xué)會(huì)/美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)基金會(huì)/美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)/世界心臟聯(lián)盟(European Society of Cardiology/American College of Cardiology Foundation/American Heart Association/World Heart Federation, ESC/ACCF/AHA/WHF)第3版《心肌梗死全球統(tǒng)一定義》[6]。穩(wěn)定型心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)制定的《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：急慢性感染性疾病、急性腦血管意外、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病或結(jié)締組織疾病等。本研究所有患者均遵循自愿原則，簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 所有入選患者完善一般臨床資料，包括年齡、性別、血壓、吸煙史、慢性病史(高血壓病、糖尿病、血脂異常)等。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有患者入院即刻檢測(cè)肝功能、腎功能、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myocardial band, CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)水平，次日清晨空腹抽血，檢測(cè)血脂、血糖等生化指標(biāo)。同時(shí)抽取靜脈血5 mL，離心獲取血漿置于無RNA酶的EP試管中，-80℃冰箱低溫保存待測(cè)。

1.2.3 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)血漿miR-590水平 TRIzol法提取血漿總RNA，并使用核酸蛋白分析儀對(duì)獲得的RNA純度進(jìn)行檢測(cè)。取純化的總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，選用U6作為內(nèi)參。反應(yīng)引物序列如下：miR-590，上游5’-GGAATTCTTCAGTTGTAACCCAG-3’，下游5’-CGGGATCCTTGAGATGTCA CCAA-3’；U6，上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，循環(huán)40次，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。采用2-ΔΔt法計(jì)算miR-590相對(duì)量。

1.2.4 隨訪 出院后每月定期隨訪，以電話隨訪為主，輔以門診隨訪或住院隨訪，隨訪時(shí)間為1年，記錄所有患者出院后1年內(nèi)MACE發(fā)生情況，包括非致命性心肌梗死、心力衰竭、心源性死亡、再次血運(yùn)重建。

2 結(jié)果

2.1 3組對(duì)象基線資料比較 3組對(duì)象性別、年齡、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、總膽固醇(total cholesterol, TC)、三酰甘油(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和血肌酐(serum creatinine, SCr)進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組對(duì)象基線資料比較

2.2 3組對(duì)象血漿miR-590、cTnI及CK-MB水平比較 3組對(duì)象血漿miR-590、cTnI及CK-MB水平進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。AMI組患者血漿miR-590、cTnI及CK-MB水平高于SAP組和HC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SAP組與HC組血漿miR-590、cTnI及CK-MB水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組對(duì)象血漿miR-590、cTnI及CK-MB水平比較

2.3 AMI組患者血漿miR-590與cTnI、CK-MB水平相關(guān)性分析 AMI組患者血漿miR-590水平與cTnI呈正相關(guān)(r=0.751，P<0.001)，血漿miR-590水平與CK-MB呈正相關(guān)(r=0.692，P<0.001)。見圖1、2。

圖1 AMI組患者血漿miR-590水平與cTnI相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖2 AMI組患者血漿miR-590水平與CK-MB相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4 低miR-590組與高miR-590組患者M(jìn)ACE發(fā)生情況比較 AMI組患者出院后隨訪1年，隨訪期間2例對(duì)象失訪。根據(jù)血漿miR-590水平中位數(shù)，將AMI組患者分為低miR-590組(miR-59<1.72,n=35)與高miR-590組(miR-590≥1.72,n=35)。與低miR-590組相比，高miR-590組MACE發(fā)生率增高(P=0.015)；其中兩組心力衰竭發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040)，但非致命性心肌梗死、心源性死亡以及再次血運(yùn)重建差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 低miR-590組與高miR-590組對(duì)象MACE發(fā)生情況比較[例(%)]

3 討論

AMI是全球范圍內(nèi)的重大衛(wèi)生問題，其發(fā)病率及病死率均較高?？焖僭\斷以及早期再灌注對(duì)于降低病死率和改善預(yù)后至關(guān)重要。盡管cTnI、CK-MB等傳統(tǒng)心肌損傷標(biāo)志物在AMI的診療中具有無法替代的作用，但是這些標(biāo)志物仍然存在敏感性及特異性較低等缺陷[8]。miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA，廣泛參與生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖分化與凋亡、腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程[9]。相關(guān)研究[10]表明，miRNA可作為AMI早期診斷的生物標(biāo)志物。Eulalio等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-590顯著刺激小鼠心肌梗死后的心肌再生，幾乎完全恢復(fù)心臟功能參數(shù)。因此，探究新的生物標(biāo)志物對(duì)AMI患者的早期診斷、早期治療以及預(yù)后評(píng)估具有重要的意義。

本研究結(jié)果顯示，AMI患者血漿miR-590表達(dá)量高于SAP組和HC組，提示miR-590可以作為AMI的一種重要生物標(biāo)志物。進(jìn)一步分析AMI患者血漿miR-590 水平與傳統(tǒng)心肌損傷標(biāo)志物的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-590與cTnI及CK-MB均呈正相關(guān)，提示血漿miR-590 水平可以反映出心肌損傷的程度，且3者聯(lián)合檢測(cè)有望提高AMI的檢出率，為早診斷早治療提供可能性。本研究發(fā)現(xiàn)，高miR-590組患者心力衰竭及MACE總體發(fā)生率更高，預(yù)后更差，提示血漿miR-590水平可作為評(píng)估AMI患者預(yù)后的指標(biāo)。

AMI的病理基礎(chǔ)為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成是血管壁對(duì)血脂異常和內(nèi)皮損傷做出的慢性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，包括白細(xì)胞的炎性募集和血管壁細(xì)胞的活化。既往研究[4-5，12-13]發(fā)現(xiàn)，miR-590能夠抑制內(nèi)皮損傷和凋亡，減輕巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累和炎癥細(xì)胞因子的分泌，減少主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積及斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量。外源性給予miR-590干預(yù)心臟成纖維細(xì)胞能夠通過抑制TGF-βRII表達(dá)，抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的膠原蛋白分泌以及肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)[14]。表明miR-590可能通過調(diào)控脂質(zhì)代謝、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的激活與凋亡、心肌細(xì)胞增殖以及炎癥基因的表達(dá)等過程參與到AMI的病理過程中。

綜上所述， AMI患者的血漿miR-590水平明顯升高，miR-590的表達(dá)水平與AMI患者的預(yù)后相關(guān)。因此，血漿miR-590水平監(jiān)測(cè)可為臨床醫(yī)師診斷AMI以及評(píng)估預(yù)后提供參考。然而，本研究具有樣本量較小、缺乏多中心隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的局限性，同時(shí)也未對(duì)miR-590與 AMI 發(fā)生發(fā)展關(guān)系進(jìn)行機(jī)制探討。下一步有必要擴(kuò)大樣本量，并聯(lián)合其他醫(yī)療單位開展多中心臨床研究，進(jìn)一步深入探討 miR-590參與AMI發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為臨床AMI的診治提供更為充分的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。