自噬在結(jié)核菌素誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成中的作用及機(jī)制

王增順，索南昂秀*，劉立民，周京元，伍 驥

1.青海省人民醫(yī)院骨科，西寧 810000

2. 中國(guó)人民解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心骨科，北京 100142

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的呼吸道傳染病，結(jié)核分枝桿菌經(jīng)血液循環(huán)侵入骨關(guān)節(jié)后引起骨關(guān)節(jié)結(jié)核。脊柱結(jié)核是最常見的骨關(guān)節(jié)結(jié)核，以進(jìn)行性骨質(zhì)破壞為主要特征［1-2］。破骨細(xì)胞由前體細(xì)胞單核巨噬細(xì)胞分化而來(lái)，并介導(dǎo)骨質(zhì)吸收，破骨細(xì)胞的異常增殖及分化在骨質(zhì)破壞中起關(guān)鍵作用。多項(xiàng)骨關(guān)節(jié)結(jié)核的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，結(jié)核菌素對(duì)單核巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化過(guò)程具有促進(jìn)作用，但與這一作用相關(guān)的分子機(jī)制尚不十分清楚。

自噬是近年發(fā)現(xiàn)的與結(jié)核分枝桿菌感染、骨質(zhì)疏松發(fā)生密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。在骨質(zhì)疏松的發(fā)生過(guò)程中，自噬對(duì)破骨細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用，使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素干預(yù)后，單核巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯增多［5］。在結(jié)核分枝桿菌感染單核巨噬細(xì)胞的過(guò)程中，自噬激活明顯，多種自噬基因（Atg5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）的表達(dá)增加［6-7］。但結(jié)核分枝桿菌激活單核巨噬細(xì)胞自噬的作用是否與其促進(jìn)破骨細(xì)胞形成有關(guān)并未明確。因此，本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察自噬在結(jié)核菌素誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成中的作用及機(jī)制，旨在為闡明脊柱結(jié)核發(fā)生過(guò)程中骨質(zhì)破壞的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心，結(jié)核菌素純化蛋白衍生物（PPD）注射液（規(guī)格50 IU/mL、1 mL/支）購(gòu)自北京祥瑞生物制品有限公司，自噬抑制劑3-甲基腺苷（3-MA）、自噬激動(dòng)劑雷帕霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒、TRAP活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成研究院，Beclin-1、LC3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RAW264.7細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80% ~ 90%后用0.25%胰蛋白酶消化，傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)并進(jìn)行分組給藥。對(duì)照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理，PPD組分別用含有1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL PPD的培養(yǎng)基處理，5.0 IU/mL PPD+激動(dòng)劑組用含有 5.0 IU/mL PPD+100 nmol/L 雷帕霉素的培養(yǎng)基處理，5.0 IU/mL PPD+ 抑制劑組用含有5.0 IU/mL PPD+2 mmol/L 3-MA的培養(yǎng)基處理。雷帕霉素的劑量參照陸明等［8］的報(bào)道，3-MA的劑量參照徐亦文等［9］的報(bào)道。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組給藥培養(yǎng)24 h后，采用MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。每孔加入200 μL檢測(cè)液，同時(shí)設(shè)置不接種細(xì)胞的檢測(cè)液作為空白組，37℃孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處的光密度值，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組光密度值-空白組光密度值）/（對(duì)照組光密度值-空白組光密度值）×100%。

1.4 破骨細(xì)胞形成的檢測(cè)

將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組給藥培養(yǎng)7 d后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，采用TRAP染色試劑盒進(jìn)行染色，用蘇木精復(fù)染。在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，對(duì)TRAP陽(yáng)性染色的破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 TRAP活力檢測(cè)

將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組給藥培養(yǎng)7 d后，收集培養(yǎng)基，采用TRAP活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。加入反應(yīng)底物后孵育3 h，然后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)540 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.6 自噬小體的檢測(cè)

將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組給藥培養(yǎng)7 d后，用2.5%戊二醛溶液固定。用1%鋨酸4℃處理1 h，經(jīng)70%、80%、95%、100%乙醇溶液梯度脫水后，用環(huán)氧樹脂包埋，-80℃聚合24 h，之后用3%檸檬酸鉛染色。在透射電鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，對(duì)自噬小體進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 自噬相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)基因的蛋白表達(dá)。將RAW264.7細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組給藥培養(yǎng)7 d后，用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，測(cè)定蛋白含量。取30 μg蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF膜1 h。PVDF膜用1∶1 000稀釋的 Beclin-1、LC3抗體或1∶2 500稀釋的β-actin抗體4℃孵育過(guò)夜，次日洗膜3次后，再用1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育1 h。在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，測(cè)定灰度值，以Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ與β-actin的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較；以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度PPD對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組相比，1.0、2.5、5.0 IU/mL PPD 組細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05，圖1）；10.0 IU/mL PPD組細(xì)胞活力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖1）。

圖1 不同濃度PPD對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effect of PPD at different concentrations on cell viability

2.2 不同濃度PPD對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響

與對(duì)照組相比，1.0 IU/mL PPD組破骨細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)基中TRAP活力增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05，圖2）；2.5、5.0、10.0 IU/mL PPD 組破骨細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)基中TRAP活力均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖2）。

圖2 不同濃度PPD對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響Fig. 2 Effect of PPD at different concentrations on differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts

2.3 不同濃度PPD對(duì)RAW264.7細(xì)胞自噬水平的影響

與對(duì)照組相比，1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL PPD組RAW264.7細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖3、4）。

圖3 不同濃度PPD對(duì)RAW264.7細(xì)胞中自噬小體數(shù)量的影響Fig. 3 Effect of PPD at different concentrations on number of autophagosomes in RAW264.7 cells

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同濃度PPD誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞中、LC3的表達(dá)Fig. 4 Expression of Beclin-1 and LC3 in RAW264.7 cells induced by PPD at different concentrations detected by Western blotting

2.4 自噬激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)PPD誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞自噬水平的影響

自噬激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力均無(wú)明顯影響（圖5）。與對(duì)照組比較，5.0 IU/mL PPD組RAW264.7細(xì)胞中自噬小體數(shù)量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖6、7）。與5.0 IU/mL PPD 組比較，5.0 IU/mL PPD+激動(dòng)劑組RAW264.7細(xì)胞中自噬小體數(shù)量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達(dá)水平均明顯增加，5.0 IU/mL PPD+ 抑制劑組RAW264.7細(xì)胞中自噬小體數(shù)量及Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達(dá)水平均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖6、7）。

圖5 自噬激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)5.0 IU/mL PPD誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 5 Effects of autophagy agonist and inhibitor on viability of RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction

圖6 自噬激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)5.0 IU/mL PPD誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞中自噬小體數(shù)量的影響Fig. 6 Effects of autophagy agonists and inhibitors on number of autophagosomes in RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction

圖7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)5.0 IU/mL PPD誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞中Beclin-1、LC3表達(dá)的影響Fig. 7 Effects of autophagy agonists and inhibitors on expression of Beclin-1 and LC3 in RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction detected by Western blotting

2.5 自噬激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)5.0 IU/mL PPD 誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響

與對(duì)照組比較，5.0 IU/mL PPD 組RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的數(shù)量及培養(yǎng)基中TRAP的活力增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖8）；與5.0 IU/mL PPD組比較，5.0 IU/mL PPD+ 激動(dòng)劑組RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的數(shù)量及培養(yǎng)基中TRAP的活力增高，5.0 IU/mL PPD+ 抑制劑組RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的數(shù)量及培養(yǎng)基中TRAP的活力降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖8）。

圖8 自噬激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)5.0 IU/mL PPD誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響Fig. 8 Effect of autophagy agonist and inhibitor on differentiation of RAW264.7 cells after 5.0 IU/mL PPD induction into osteoclasts

3 討 論

進(jìn)行性的骨質(zhì)破壞是脊柱結(jié)核的特征，主要累及椎體，可引起椎體塌陷、脊髓壓迫，嚴(yán)重者出現(xiàn)脊柱后凸畸形或截癱［10］。破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一一種介導(dǎo)骨質(zhì)吸收功能的終末細(xì)胞，在正常組織中含量極少，在病理?xiàng)l件下可由單核巨噬細(xì)胞分化而來(lái)。在脊柱結(jié)核發(fā)生過(guò)程中，破骨細(xì)胞與骨質(zhì)破壞密切相關(guān)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PPD能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。梁思敏等［3，11］使用1.0 IU/mL和10.0 IU/mL PPD 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞，但10.0 IU/mL PPD 會(huì)影響RAW264.7細(xì)胞活力。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)1.0 ~ 10.0 IU/mL 的濃度區(qū)間進(jìn)行了細(xì)化，使用1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL的PPD對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)僅10.0 IU/mL PPD 會(huì)使RAW264.7細(xì)胞活力降低，其余3種濃度PPD不影響RAW264.7細(xì)胞活性 ；1.0 IU/mL PPD 雖不影響細(xì)胞活性，但也未能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞，而其余3種濃度PPD能夠明顯增加破骨細(xì)胞數(shù)量，具有促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的作用。

目前，PPD誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的作用已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，但與之相關(guān)的分子機(jī)制尚不十分清楚。有研究［12-14］報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌感染對(duì)單核巨噬細(xì)胞的自噬具有激活作用，自噬的激活可能有利于病原菌的清除，但過(guò)度自噬也可能引起組織損傷。本研究采用不同濃度PPD誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.0、2.5、5.0、10.0 IU/mL的PPD均能激活自噬，自噬小體數(shù)目及自噬基因Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的表達(dá)均明顯增加，與既往研究結(jié)果一致。

骨質(zhì)疏松的多項(xiàng)研究［8-9，15-16］發(fā)現(xiàn)，自噬與骨代謝密切相關(guān)，成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均受到自噬調(diào)控，當(dāng)自噬發(fā)生抑制時(shí)，破骨細(xì)胞的分化明顯受阻。為了闡明PPD激活自噬在RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞中的作用，本研究分別使用了自噬激動(dòng)劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在5.0 IU/mL PPD誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的過(guò)程中加用雷帕霉素或3-MA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活自噬能夠增強(qiáng)PPD誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的作用、抑制自噬能夠削弱PPD誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的作用，表明自噬在PPD誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用。

綜上所述，PPD誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的作用與自噬激活有關(guān)，這為今后研究脊柱結(jié)核發(fā)生過(guò)程中骨質(zhì)破壞的發(fā)生機(jī)制提供了新思路，也為研究脊柱結(jié)核新的防治靶點(diǎn)提供了理論參考。但目前PPD激活自噬的機(jī)制尚不十分清楚，有研究［17-18］認(rèn)為，mTOR、AMPK等經(jīng)典的自噬調(diào)控通路在PPD激活自噬中起調(diào)控作用，也有研究［19-20］認(rèn)為，miR-18a、miR-125b-5p等非編碼RNA在PPD激活自噬中起調(diào)控作用，但具體機(jī)制仍有待今后更多的研究證實(shí)。