太子參復方對脾虛自汗大鼠的止汗作用及其機制研究

周春權 趙 立 蔣 暢 胡 娟，2*

1.福建省中醫藥科學院，福建 福州 350003;2.福建中醫藥大學，福建 福州 350122

中醫認為，汗是人體內的津液受到陽氣的蒸騰氣化作用而從汗孔排出來的水液。在炎熱的天氣、室內溫度過高、衣褥過厚或者精神緊張等情況下常常出現生理性多汗。如果出汗的部位、出汗量的多少、以及汗液的顏色和汗液的氣味發生改變，可以通過這些來判斷身體可能患的一些疾病。汗液生成與排泄的異常將導致多種汗證[1-2]。自汗是由于人體陰陽失衡，腠理不固，而引起人體津液外泄失常所產生的病證。

太子參復方[3]以福建道地藥材太子參、藍花參為原料。太子參具有益氣補脾和生津潤肺的功效；藍花參具有補虛健脾，補虛損，止自汗、盜汗，除虛熱，止咳化痰等功效。在中醫藥傳統理論的指導下，合理組方；二者配伍共奏益氣養陰、補虛健脾，具有治療脾虛自汗之功效。本文通過建立脾虛自汗大鼠模型，觀察太子參復方對脾虛自汗大鼠的止汗作用以及探討其止汗的機制。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 SD大鼠，SPF級，雌雄各半,體質量(180±20)g，上海伊萊克斯實驗動物中心，許可證編號：Scxk(瀘)2017-0005。

1.2 實驗材料 和田-高垣氏試劑A、B(A液：碘濃度為2%無水乙醇溶液；B液：稱取可溶性淀粉50 g，加入100 mL花生油中混勻)，硝酸毛果蕓香堿(國藥準字 H42021102，批號：13110401，武漢五景藥業有限公司)；利血平注射液(國藥準字 H12020905，批號：1210111，天津金耀氨基酸有限公司)； AchR抗體(Cell Signaling)、β-Actin抗體(Cell Signaling)、二抗(SAB))均購自CWbio.Co.Ltd公司。

1.3 儀器 電子天平(德國Sartorius)，脫色搖床(海門其林貝爾)，電泳儀(北京六一儀器廠)，垂直電泳槽、轉印模塊(美國Bio-Rad),高速離心機(Thermo)，NanoDrop 2000型分光光度計(Therno scientific)，7500熒光定量PCR儀(ABI)。

1.4 藥物 太子參復方，本實驗室自制，按專利[3]進行制備。全腦組織：實驗結束后，大鼠處死，在冰面上迅速取出全腦，分裝于EP管內，-80 ℃保存，備用。

2 方法

2.1 止汗作用實驗

2.1.1 脾虛自汗大鼠模型的建立[4]采用利血平所致脾虛大鼠的方法建立模型，動物房適應性喂養1周，按體重隨機分成5組，即：正常對照組，模型對照組，太子參復方高、中、低組。除正常對照組外，其余各組每天上午，以利血平0.5 mg·kg-1腹腔注射，連續14 d，制備脾虛型大鼠，并觀察動物行為。

2.1.2 給藥與實驗 給藥組于造模的第8天開始，每天下午灌胃給藥，正常對照組和利血平組給等體積的蒸餾水，太子參復方高、中、低組(2.4、1.2、0.6 g·kg-1)，分別按成人臨床推薦劑量的5倍、10倍、20倍灌胃，連續給藥14 d。分別在開始給藥的第1、7、14天，末次給藥后45 min皮下注射毛果蕓香堿液35 mg·kg-1(正常組注射生理鹽水)，15 min將動物轉入固定器內，右后足固定籠外，適應15 min，用棉簽蘸上無水乙醇輕輕將足跖部污物擦拭干凈，于大鼠足跖部皮膚涂上和田-高恒氏試劑A液，待干燥后，再薄薄涂上B液，然后于15 min后用10倍放大鏡計數深紫色著色點(即汗點)的數目。

2.2 Western Blot法檢測乙酰膽堿受體的表達量實驗 將腦組織剪切成小塊，稱重，按每20 mg組織加400 μL的比例加入裂解液，提取總蛋白，用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量，取相同質量蛋白變性上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜。封閉液封閉 2 h后置于一抗稀釋液[AchR(1∶300)，β-actin(1∶1 000)]4 ℃過夜。次日洗膜，加入二抗稀釋液[SAB(1∶3000)]孵育 1 h，用化學發光法于暗室中曝光、顯影、定影。凝膠成像儀攝像后用image J軟件分析灰度值。

2.3 RT-PCR法檢測乙酰膽堿受體mRNA的表達實驗

2.3.1 引物設計 本實驗采用的AchR基因及內參基因的引物序列。見表1。

表1 引物序列表

2.3.2 實驗步驟 將腦組織剪切成小塊，稱重，用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA；取RNA進行電泳，檢測RNA的完整性；用DNase Ⅰ試劑盒對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理；用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄。

2.3.3 Real-Time PCR進行分析 用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△ct法進行數據的相對定量分析。

3 結果

3.1 太子參復方對脾虛自汗大鼠模型的影響 由表2可知，正常對照組與模型組比較，均有顯著性差異；而給藥組的高、中劑量組在第7天和第14天，止汗效果明顯，與模型組比較具有顯著性差異，低劑量組則差異不顯著。

表2 太子參復方對脾虛自汗大鼠模型的影響

3.2 太子參復方對脾虛大鼠體重的影響 由表3可知，實驗前各組大鼠體重差異無顯著性，造模后，模型組及3個太子參復方劑量組大鼠體重增長幅度較正常對照組下降(P<0.05)。實驗后, 3個太子參復方劑量組大鼠的體重略高于模型組，說明本方具有一定健脾效果，但其與模型組之間的差異無顯著性，可能服藥時間較短，隨著實驗時間延長，健脾效果更顯著，對大鼠體重影響更大。

表3 太子參復方對脾虛大鼠體重的影響

3.3 太子參復方對脾虛自汗模型大鼠的AchR蛋白含量影響 經過Western Blot 分析曝光及洗片后結果如圖1所示。

計算乙酰膽堿受體的相對灰度值，采用公式：乙酰膽堿受體的相對灰度值=乙酰膽堿受體灰度值/肌動蛋白灰度值，計算結果見表4。

表4 太子參復方中對脾虛自汗模型大鼠AChR蛋白表達灰度值的影響

以上實驗結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠腦組織AchR蛋白的表達明顯增加，不同劑量太子參復方能不同程度降低模型大鼠腦組織中AchR蛋白的表達，與模型組比較，太子參復方高、中劑量組AchR蛋白的表達明顯下降(P<0.01)。

3.4 RNA完整性及純度檢測 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，28 s和18 s rRNA條帶清晰明亮，表明RNA完整性良好，微量紫外分光光度計測定RNA的吸光度，其OD260/280值均在1.8～2.1之間，表明RNA純度較高，無雜質污染(圖2)。

3.5 Real-Time PCR檢測結果 各樣本目的基因和內參基因實時擴增曲線和溶解曲線圖(圖3、圖4)顯示引物特異性良好。

3.6 相對定量分析結果 按照2-△△ct相對定量法，計算各樣品的目的基因相對定量結果，即各個樣品對于對照樣品，目的基因mRNA轉錄水平的差異，與正常對照組比較，模型組大鼠AchR mRNA表達顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組AchR mRNA表達顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。提示太子參復方能夠下調脾虛自汗大鼠大腦中AchR mRNA，表達結果如表5所示。

表5 太子參復方對脾虛自汗模型大鼠AchR mRNA相對表達量的影響

4 討論

利血平是屬于外圍交感神經抑制藥或去甲腎上腺素能神經末梢阻斷藥，利血平能夠抑制交感神經系統的功能，使得副交感神經系統的功能就相對占優，就會出現和中醫脾虛證有高度相似的癥狀，如鼻粘膜血管擴張而鼻塞，消化功能亢進而致大便次數增多、胃酸分泌增加、潰瘍病等。利血平可用于多種動物制成脾虛模型,其表現的癥狀與人類最常見脾虛證型很相似。這種造模方法簡單易行,可靠性和重現性強。同時其發病機制有相當一部分與膽堿能神經功能亢進、植物神經功能紊亂有關。出汗是一種植物神經調控性活動，交感神經和副交感神經是調節人體內臟功能的神經裝置，其功能為調節心肌、平滑肌和腺體(包括消化腺、汗腺、部分內分泌腺)的活動，一般汗腺由交感神經支配。交感和副交感神經節前纖維釋放的遞質是乙酰膽堿。故神經遞質乙酰膽堿的變化可能是調控機體汗腺出汗量的機理之一。

實驗結果表明大鼠在經過注射利血平之后，出現了明顯的體重下降的情況，說明大鼠產生了脾虛的癥狀，脾虛后的大鼠在注射毛果蕓香堿液之后，汗液的量有明顯的增加，表明脾虛自汗模型大鼠的成功建立。本研究對太子參復方的止汗機制進行了初步探討，實驗中檢測到正常的大鼠也有微量的AchR mRNA 表達，刺激脾虛自汗模型造模后，大腦內AchR表達顯著增高，說明脾虛自汗能激活AchR信號通路的活化，但是否直接激活，還有哪些參與作用的相關蛋白，有待下一步繼續研究。