不同粒徑10%戊唑醇懸浮劑對非靶標生物毒性和抑菌活性比較

葛兆悅，袁善奎，張小軍，侯玉霞

(1.農業農村部農藥檢定所，北京 100125；2.農業農村部農藥評價重點實驗室，北京 100125；3.中農立華生物科技股份有限公司，北京 100052; 4.中國農業大學理學院，北京 100193)

農藥從原藥加工成制劑產品后，其有效成分的粒徑在產品穩定性、靶標生物活性和持留期方面起著至關重要的作用。農藥懸浮劑是原藥與助劑等分散在水中經研磨后制得的懸浮液體，有效成分以固體微粒形式穩定的分散在水中，微粒的粒徑通常在4μm以下，被認為是高效、環保的水基化劑型。一般來說，農藥粒徑減小，粒徑分布變窄，分散性和滲透性更好，生物活性越高，從而間接影響到制劑產品對環境非靶標有益生物的毒性及對靶標的生物活性，但農藥制劑粒徑細化對設備要求高、研磨時間長、能耗也增加。因此，在實際農藥懸浮劑劑型產品研發過程中，應從經濟性、安全性、有效性等方面綜合考慮設計粒徑大小。

本研究以3μm、1μm和300nm等不同粒徑的10%戊唑醇懸浮劑為試驗材料，通過比較其對蜜蜂、家蠶、斑馬魚、大型溞和羊角月芽藻5種非靶標有益生物的毒性，以及在離體條件下對赤霉菌、稻瘟病菌和小麥白粉病菌的抑菌活性和活體上黃瓜白粉病的防治效果，綜合分析粒徑大小對戊唑醇懸浮劑生態毒性和抑菌活性的影響，旨在為開發經濟、高效和環保的農藥懸浮劑提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑 300nm、1μm 、3μm粒徑的10%戊唑醇懸浮劑，所用助劑均為TAMOL DN、Sokalan CP-9 、1,2-丙二醇、SAG 1522、黃原膠、卡松等；95%戊唑醇原藥。

1.1.2 供試非靶標有益生物 意大利成年工蜂，購自中國農科院蜜蜂研究所；家蠶，蠶卵購自山東廣通蠶種集團有限公司，品種為菁松×皓月；斑馬魚，購自北京宏大高峰水族用品經營部；大型溞和羊角月芽藻，購自中國科學院水生生物研究所。

1.1.3 供試植物病原菌 小麥赤霉菌、稻瘟病菌、小麥白粉病菌、黃瓜白粉病菌菌株均由農業農村部農藥檢定所實驗室保存。

1.1.4 供試植物品種 小麥品種為淮麥33，黃瓜品種為北京刺瓜。

1.2 非靶標生物毒性測試方法

1.2.1 蜜蜂急性經口毒性試驗 參照GB/T 31270.10[1]方法，用50%蔗糖水將供試藥劑配制不同濃度藥液，將貯蜂籠內的蜜蜂引入試驗籠中，飼喂器中加入試驗藥液，供蜜蜂攝食。試驗溫度25±2℃，相對濕度50%～70%，光照條件為黑暗，試驗開始后24、48h觀察并記錄蜜蜂中毒癥狀及死亡數。

1.2.2 家蠶急性毒性試驗 參照GB/T 31270.11[2]浸葉法，供試用蠶為二齡起蠶，試驗溫度均為25±1℃，相對濕度70%～80%，光照/黑暗時間比16/8h，試驗開始后24、48、72和96h觀察并記錄家蠶中毒癥狀及死亡數。

1.2.3 大型溞急性活動抑制試驗 參照GB/T 31270.13[3]靜態法，試驗水溫20±1℃，光照/黑暗時間比16/8h，試驗周期48h。試驗開始后24、48h觀察并記錄大型溞的中毒癥狀和受抑制數。

1.2.4 斑馬魚急性毒性試驗 參照GB/T 31270.12[4]靜態法，試驗水溫24±1℃，光照/黑暗時間比16/8h，每隔48h更換一次試驗藥液，試驗周期96h。試驗開始后24、48、72和96h觀察并記錄斑馬魚的中毒癥狀及各處理的死亡數。

1.2.5 藻類生長抑制試驗 參照GB/T 31270.13[5]方法，將綠藻染毒后放入智能人工氣候箱，培養溫度22±1℃，光照/黑暗時間比16/8h，試驗周期72h。試驗開始后24、48、72h，用分光光度法測定各處理藻液細胞濃度。

1.2.6 大型溞繁殖試驗 參照GB/T 21828-2008[6]方法，試驗開始后每48h更換試驗藥液，試驗水溫20±1℃，光照/黑暗時間比16/8h，試驗周期21d內，每24h觀察記錄產溞數，并取出新生幼溞。

1.3 對植物病原菌的活性測定方法

1.3.1 小麥赤霉菌的室內毒力測定 采用菌絲生長速率法，將直徑5mm的小麥赤霉菌菌餅接種在含有系列梯度供試藥劑的PDA平板中心，于25℃培養96h，十字交叉法測定菌落直徑，計算生長抑制率。

1.3.2 稻瘟病菌的室內毒力測定 采用菌絲生長速率法，將直徑5mm的稻瘟病菌菌餅接種在含有系列梯度供試藥劑的PDA平板中心，于25℃黑暗培養7d，十字交叉法測定菌落直徑，計算生長抑制率。

1.3.3 小麥白粉病菌的室內毒力測定 采用離體葉段法[7]，室內盆栽的健康小麥長至一葉一心后，剪取2cm長第一葉上部葉段，系列梯度藥液浸濕，晾干后放置在含相應濃度供試藥劑和50mg/L苯并咪唑的固體瓊脂培養基表面，用抖落孢子法接種，置于恒溫培養箱，溫度18℃，光照/黑暗時間比16/8h，培養7d，按發病情況分級標準記錄病情，計算相應的病情指數和防治效果。

1.3.4 黃瓜白粉病的防治效果測定 采用盆栽測定法[8]，黃瓜兩片真葉展開后，使用噴霧器將系列梯度藥液均勻噴灑于盆栽黃瓜葉片正面，至藥液剛好不下滴，自然晾干。 24h后收集新鮮病葉上的黃瓜白粉，配制濃度為4.0×104個/mL孢子懸浮液，均勻噴灑于盆栽黃瓜葉片。室內溫度25℃培養至對照明顯發病，參照《農藥田間藥效試驗準則 殺菌劑防治黃瓜白粉病》調查發病情況，并計算相應的病情指數和防治效果。

1.4 數據分析 用SPSS 22.0處理試驗結果。急性毒性試驗分別計算供試藥劑對試驗生物的半致死劑量(LD50)、半致死濃度(LC50)、抑制效應濃度(EC50)，及95%置信區間，比較各藥劑之間毒性的差異顯著性。大型溞繁殖試驗的試驗數據，采用單因素方差分析(P<0.05)，得出不同藥劑處理下產溞總數的無可觀察效應濃度(NOEC)、最低可觀察效應濃度(LOEC)。室內毒力測定試驗分別計算供試藥劑對病原菌生長半抑制效應濃度(EC50)或防治效果及95%置信區間，比較各藥劑之間室內抑菌活性的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 對非靶標生物的毒性

2.1.1 急性毒性 供試藥劑對非靶標生物急性毒性試驗結果(表1～5)。結果表明，在3個不同粒徑的10%戊唑醇懸浮劑，300nm 粒徑對蜜蜂急性經口毒性為中毒(其他為低毒)，對家蠶急性毒性均為低毒，對大型溞、斑馬魚急性毒性均為中毒，總體上表現出對上述4種生物隨著粒徑變小毒性升高的趨勢。3種制劑對羊角月芽藻生長抑制毒性均為中毒，表現出粒徑變小毒性降低的趨勢，1μm和300nm粒徑10%戊唑醇懸浮劑 顯著低于3μm粒徑10%戊唑醇懸浮劑。

表1 對蜜蜂的急性經口毒性

表2 對家蠶的急性毒性

表3 對大型溞的急性活動抑制毒性

表4 對斑馬魚的急性毒性

表5 對羊角月芽藻的生長抑制毒性

2.1.2 對大型溞的繁殖毒性 統計試驗期間各個母溞的產溞總數，以供試藥劑對21d大型溞繁殖量(每只非意外死亡的親溞所產幼溞總數)的影響作為評價指標，基于設計濃度，得到供試藥劑處理的大型溞21d產溞總數NOEC為0.393mg a.i./L，LOEC為0.492mg a.i./L，不同粒劑的10%戊唑醇懸浮劑對大型溞的繁殖無顯著差異。

2.2 對植物病原菌的抑制活性

2.2.1 離體抑菌活性 粒徑為3μm、1μm、300nm的3種10%戊唑醇懸浮劑對小麥赤霉菌、稻瘟病菌、小麥白粉病菌的室內毒力測定結果(表6～8)。結果表明，戊唑醇對不同病原菌的活性不同。對于同一種病原菌，不同粒徑的戊唑醇懸浮劑的抑菌活性無顯著差異。

表6 對小麥赤霉菌的抑菌活性

表7 對稻瘟病菌的抑菌活性

表8 對小麥白粉病菌的抑菌活性

2.2.2 活體上的抑菌活性 在活體黃瓜小苗上，50mg a.i./L濃度的3μm、1μm、300nm10%戊唑醇懸浮劑處理的黃瓜白粉防治效果分別為22.2%、27.8%、16.7%，100mg a.i./L濃度處理的防治效果分別61.1%、61.1%、66.7%，未表現明顯的抑菌活性差異。

3 結論與討論

有效成分顆粒粒徑是農藥制劑重要的物理參數之一。農藥粒徑大小對其毒性的影響早有研究，主要針對溶解度低的原藥和粉劑，如百菌清原藥、吩噻嗪、硫磺粉等[9]，通常認為水中溶解度增加、接觸幾率的提高是生物活性提高的原因。本研究中，蜜蜂急性經口試驗的劑量對應的藥劑濃度最高，遠高于戊唑醇在水中的溶解度，粒徑大小對分散性能的影響最為顯著，相應地由于對水生生毒性試驗設計濃度較低，粒徑大小的影響在溶解的過程中被削弱，所以導致毒性差異小或無顯著差異。與其他非靶標生物相比，懸浮劑粒徑大小對藻類的毒性影響呈現不同趨勢，即粒徑越小，對藻類毒性越低，這可能是粒徑越大對藻細胞的物理吸附性越強，從而影響其生長。

農藥顆粒粒徑也會影響其藥效，如早已證實顆粒粒徑在微米范圍內，幾微米的農藥顆粒殺菌、殺蟲活性遠高于十幾微米或幾十微米的農藥顆粒[9]。本章研究中，300nm～3μm范圍內，粒徑大小對戊唑醇懸浮劑在離體條件下小麥赤霉菌、稻瘟病菌、小麥白粉病菌的抑制活性以及在黃瓜活體上黃瓜白粉病的防治效果也無明顯影響，但更小粒徑的制劑也可能會對藥效產生較為顯著的影響。

綜上所述，本研究證明對于10%戊唑醇懸浮劑，在300nm～3μm粒徑范圍內，粒徑變化對非靶標生物的毒性有一定的影響，但對植物病原菌的活性方面沒有造成顯著影響，該制劑在300nm甚至100nm以下是否會對毒性和抑菌活性造成顯著影響尚待進一步研究。近年來，納米農藥已成為研究的熱點，農藥制劑納米化之后是否會提高其對環境生物的風險應值得關注，在實際產品開發中涉及有效成分粒徑范圍時應綜合考慮提高藥效和改變環境安全性方面的影響。