思茅松毛蟲成蟲腸道細菌多樣性

李選文，熊 智，王金華，周藝萍，熊忠平

（1.西南林業大學生命科學學院，昆明 650224；2.西南林業大學繼續教育學院，昆明 650224；3.西南林業大學生物多樣性學院，昆明 650224）

0 引言

【研究意義】思茅松毛蟲（Dendrolimu kikuchii）隸 屬 于 鱗 翅 目（Lepidoptera）枯 葉 蛾 科（Lasiocampidae）松毛蟲屬（Dendrolimus）[1]，主要分布在我國云南、四川、湖南、湖北、貴州等省[2]。思茅松毛蟲一年發生1～2代，幼蟲共有7個齡期，以3齡越冬，在云南主要危害云南松（P.yunnanensis）、思茅松（Pinus kesiya var.langbianensis）、油杉（Keteleeria cyclolepis）等松科植物，是我國危害最為嚴重的6種松毛蟲之一[3-4]。在安徽石臺縣當思茅松毛蟲大面積爆發的時候，最高蟲口密度可達700條/株，蟲株率可達90%以上[5]；而在云南景東，每5～8年就會爆發一次大規模的思茅松毛蟲蟲害[6]。思茅松毛蟲成熟后，雌蛾多產卵于松針上，成塊狀，每一只雌蛾產卵200～800粒，一般300～500粒，產卵量最高可達1 700粒。腸道內的微生物可以為寄主提供營養、協助寄主消化食物、抵抗病原物、增強寄主免疫力等，而寄主則為腸道微生物提供一個生存場所，二者相互依存、互利共生[7-8]。隨著大量菊酯類等化學藥品的使用，在思茅松毛蟲體內也會產生抗藥性[9]。【前人研究進展】昆蟲腸道結構、環境因素、食物等都影響昆蟲腸道微生物多樣性[10-11]。昆蟲腸道一般分前、中、后腸三部分[12]腸道的復雜結構、不同的腸道部位微環境不同，進而影響微生物多樣性[13]。駱米娟等[14]采用傳統的微生物培養方法研究南亞實蠅[Bactrocera tau（Walker）]成蟲腸道可培養細菌，發現腸桿菌屬（Enterobacter）是南亞雌成蟲腸道細菌的優勢菌群，Uncultured bacterium/bacterium是南亞雄成蟲腸道可培養細菌的優勢菌群。楊曉晴等[15]采用高通量測序研究灰飛虱（Laodelphax striatellus）成蟲腸道細菌的多樣性，發現灰飛虱雌、雄成蟲體內優勢菌為醋酸桿菌科未分類屬（Unclassified Acetobacteraceae），雌成蟲體內沃爾巴克氏體屬（Wolbachia）的豐度分別為13.81%，雄成蟲體內沃爾巴克氏體屬（Wolbachia）的豐度分別為44.52%，沃爾巴克氏體屬有殺雄、孤雌生殖等現象。王蕊蕊等[16]采用傳統的微生物培養方法研究了桉樹枝癭姬小蜂（Leptocybe invasaFisher&La Salle）雌成蟲腸道可培養細菌的多樣性，共分離得到11株細菌，其中厚壁菌門（Firmicutes）中的芽孢桿菌屬（Bacillus）為優勢菌屬。劉寧等[17]采用傳統的微生物培養方法研究了中華通草蛉[Chrysoperla sinica（Tjeder）]成蟲的腸道菌群構成，發現雌成蟲的優勢菌屬為放線桿菌屬（Actinobacillus），雄成蟲的優勢菌屬為愛德華氏菌屬（Edwardsiella）。張珊等[18]采用傳統的微生物培養方法研究了思茅松毛蟲（Dendrolimus kikuchii）4齡幼蟲腸道可培養真菌，共分離鑒定出12株真菌，Pestalotiopsis microspora產蛋白酶活力最高，Penicillium chrysogenum產淀粉酶能力最高，Penicillium sclerotiorum產纖維素酶能力最高，Penicillium是優勢菌屬。王瓊等[19]對文山松毛蟲質型多角體病毒（Dendrolimus punctayusWenshanensis cytolplasmic polyhedrosis virus，DpwCPV）應 用SDS-熱酚法抽提得到基因組dSRNA，最終獲得了一個新的序列。江宇航等[20-21]采用傳統的微生物培養方法研究了馬尾松毛蟲（Dendrolimus punctatus）幼蟲腸道可培養產細菌素和產蛋白酶細菌，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）產細菌素活性最佳，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）產蛋白酶能力最高。而對云南松毛蟲（Dendrolimus houi）腸道可培養真菌的研究發現，假絲酵母（Candida catenulate）和桔青霉（Penicillium）解纖維素酶活性在中性條件下最高[22]。對落葉松毛蟲（Dendrolimus superans）和赤松毛蟲（Dendrolimusspectabilis）的研究多集中于生物學特性及防控[23-26]。【本研究切入點】國內關于鱗翅目的其他昆蟲腸道微生物多有報道，但關于思茅松毛蟲成蟲腸道細菌群落組成和多樣性鮮見報道。需研究思茅松毛蟲腸道細菌多樣性。【擬解決的關鍵問題】將以思茅松毛蟲成蟲為研究對象，基于Illumina NovaSeq（PE250）平臺運用高通量技術對思茅松毛蟲成蟲腸道細菌16S rDNA序列V3～V4高變區進行PCR擴增測序，分析對比思茅松毛蟲雌雄成蟲腸道微生物資源和多樣性，為研究思茅松毛蟲腸道微生物資源和其生物學功能以及思茅松毛蟲的種群管理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

思茅松毛蟲蟲繭采自云南省安寧市草鋪鎮森林地區（24°31′～25°6′N，102°8′～102°37′E），根據安寧市森林的情況在方圓3 hm2范圍內隨機挑選30個樣品點，每個樣品點采集10只健康的成蟲（雌雄各5只），總計300只成蟲，帶回實驗室飼養。圖1

圖1 思茅松毛蟲雄成蟲（A）、雌成蟲（B）Fig.1 Male（A）and female（B）adults of Dendrolimuskikuchii

1.2 方法

1.2.1 腸道解剖及基因組DNA提取

選取健康的雄蛾和雌蛾各50頭，在恒溫（23±1℃）、恒濕（83%±2%）條件下，每5頭幼蟲放在一個小籠子內用無菌水喂養，40 h后待其排空體內食物殘渣后進行實驗。將成蟲置于冰上3～5 min，待其昏迷；采用70%酒精擦拭蟲體表面30 s，0.25%次氯酸鈉沖泡1 min，無菌水沖洗3次；將體表消毒好的蟲子固定于無菌蠟盤上，在無菌環境下操作，使用滅菌后的細尖鉗將昆蟲腹部剖開，取出整個腸道，并立即用0.9%無菌NaCl溶液沖洗表面2次，然后將腸道取出后置于無菌離心管中，進行液氮速凍，置于-80℃保存備用，每個樣品設置3個重復。雌成蟲編號CC1-3，雄成蟲編號CX1-3。

采用E.Z.N.細菌DNA提取試劑盒參照其說明書分別提取雄蛾和雌蛾的腸道細菌總DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗抽提質量，檢測合格后保存于-80℃冰箱中備用[27]。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增和高通量測序

以提取的總DNA為模板，采用帶Barcode（338F-806R）的特異引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴增細菌16S rDNA V3～V4區域[28]。PCR擴增反應體系（25.0μL）：基因組DNA模板2.0μL，5×reaction Buffer 5.0μL，5×GC Buffer 5.0μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0μL，338F/806R（10.0 mmol/L）各1.0μL，Q5 DNA Polymerase 0.25μL，ddH2O 8.75μL。PCR擴增條件：98℃預變性2 min，98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸5 min，30個循環，72℃終延伸5 min，-20℃保存。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，采用Axygen Gel Extraction Kit（AP-GX-250G）試劑盒割膠回收。檢測合格后送至武漢貝納科技服務有限公司基于Illumina NovaSeq（PE250）平臺進行高通量測序。

1.3 數據處理

Illumina NovaSeq（PE250）測序獲得的原始數據根據index序列區分數據，并保存為fastq格式[29]，根據測序所得雙端序列PE reads的overlap關系將其拼接為一條序列，用FLASH、Trimmomatic軟件對reads質量、拼接效果過濾，并區分樣品，調整序列正反向，去除嵌合體序列，得到最終有效數據（valid tags）[30]。使用UPARSE[31]軟件對Clean Tags在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU序列，并基于Silva128/16S_bacteria庫進行比對，每個操作分類單元中把豐度最高的序列作為OTU代表，采用貝葉斯算法[32]對以上序列注釋、分類，在各分類學水平上統計各樣本群落組成[33]。使用Mothur（version v.1.30）軟件對樣品Alpha多樣性指數（Chao1，Ace，Shannon和Simpson）進行分析。使用R語言繪制稀釋曲線、Rank Abundance曲線和進行PCoA分析。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Unifrac距離并構建UPGMA樣品聚類樹，使用LEfSe軟件分析物種的差異性。

2 結果與分析

2.1 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌基因序列拼接和OUT聚類

研究表明，6個樣本共獲得原始序列1 197 458條，有效序列1 172 405條，歸為1 278個OTUs，注釋到28個門，75個綱173個目，296個科，550個屬。雄蛾有效序列389 048條，歸為724個OTUs，雄蛾有效序列783 357條，歸為994個OTUs。表1

表1 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌測序的基本信息Table 1 Sequencing information gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

2.2 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌種類組成及豐度

研究表明，在門分類水平上，思茅松毛蟲雌蛾和雄蛾的腸道細菌優勢菌門均為變形菌門（Proteobacteria），只是豐度不同。在科分類水平上，思茅松毛蟲雌蛾和雄蛾的腸道細菌優勢菌科不相同，雄蛾的優勢菌科是鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae），雌蛾的優勢菌科是歐文氏菌科（Erwiniaceae）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）。在屬分類水平上，思茅松毛蟲雌蛾和雄蛾的腸道細菌優勢菌屬不相同，雄蛾的優勢菌屬是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），雌蛾的優勢菌屬是泛生菌屬（Pantoea）。表2、圖2～4

表2 思茅松毛蟲雌雄成蟲體內在門、科和屬分類等級上相對豐度Table 2 Relative abundance at the levels of phylum,family and genus in female and male adults of Dendrolimuskikuchii（≥0.1%）

圖2 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌門水平相對豐度Fig.2 Histogram of relative abundance of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the phylum level

圖4 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌屬水平相對豐度Fig.4 Histogram of relative abundance of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the genus level

雄蛾有366種細菌數，雌蛾有462種細菌屬，二者共有的細菌屬是272種，雌蛾的腸道細菌群落結構在屬水平上比雄蛾更豐富，并且二者具有一定的相似性。圖5

圖5 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌屬水平韋恩圖Fig.5 Venn diagram of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the genus level

2.3 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌多樣性

研究表明，雌蛾和雄蛾的Coverage指數均為0.999 7，樣本樣本文庫的覆蓋率較高，進行測序分析有一定的代表性。雌蛾腸道細菌的Shannon指數（P＞0.05）、ACE指數（P＞0.05）、Chao1指數（P＞0.05）、Coverage指數（P＞0.05）均高于雄蛾，雌蛾腸道細菌的物種多樣性比雄蛾豐富。表3

圖3 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌科水平相對豐度Fig.3 Histogram of relative abundance of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii at the family level

表3 思茅松毛蟲雌雄成蟲體內在門、科和屬分類等級上相對豐度Table 3 Relative abundance at the levels of phylum,family and genus in female and male adults of Dendrolimuskikuchii

CC1樣本在水平方向上跨度最大，且在垂直方向上最平滑，雌蛾CC1樣本腸道細菌菌群的組成最為豐富且物種分布的均勻度最高。CC3樣本在水平方向上的跨度較CC1小，在垂直方向上沒CC1平滑，CC1樣本腸道細菌菌群的組成豐富度及物種分布的均勻度較CC1樣本低。CC2樣本在水平方向上跨度最大，且在垂直方向上最陡，雌蛾CC2樣本腸道細菌菌群的組成最貧乏且物種分布的均勻度最低。而雄蛾樣本CX2樣本在水平方向上的跨度較CX2-CX3大，在垂直方向上較CX2-CX3平滑，CC1樣本腸道細菌菌群的組成豐富度及物種分布的均勻度較較CX2-CX3樣本高。OTUs隨著reads數增加呈曲線狀增加，先急速增加而后變緩。reads數增加可產生的OTUs極少。圖6，圖7

圖6 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌Rank abundance曲線Fig.6 Rank abundance curve of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

圖7 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌稀釋曲線Fig.7 Observed species rarefaction curves of the gut bacteria in adults of Dendrolimus kikuchii

2.4 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌差異比較

研究表明，CC1和CX1-CX3樣本分布較近，而CC1-CC2和CX1-CX3樣本分布較遠，思茅松毛蟲雄蛾和雌蛾的腸道細菌菌群結構既有相似的地方，也有不同的地方。圖8

圖8 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌PCoAFig.8 PCoA map of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

雄蛾在豐度上有顯著差異的物種有α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、乳球菌屬（Lactococcus）、水桿狀菌屬（Aquabacterium）、柄桿菌科（Caulobacteraceae）、柄桿菌目（Caulobacterales）、不粘柄菌屬（Asticcacaulis）、叢毛單胞菌科未鑒定到屬unclassified_f__Comamonadaceae。雌蛾在豐度上有顯著差異的物種有γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、Enterobacterales、歐文氏菌科（Erwiniaceae）、泛生菌屬（Pantoea）、摩根菌科（Morganellaceae）、Erysipelatoclostridiaceae、巨單胞菌屬（Megamonas）、中華芽胞桿菌屬（Sinibacillus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、真桿菌屬（Eubacterium）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）。圖9

圖9 思茅松毛蟲成蟲腸道細菌分類差異(LEfSe)Fig.9 LEfSe analysis of the gut bacteria in adults of Dendrolimuskikuchii

3 討論

大多數昆蟲腸道微生物包括了細菌、真菌、古細菌和原生生物，而細菌豐度最高，約占90%以上，是其中的優勢菌群[34]。成蟲的優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）。在屬水平上，雄蛾的優勢菌屬是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），雌蛾的優勢菌屬是泛生菌屬（Pantoea）。王爭艷等[35]通過Illumina MiSeq高通量測序技術對赤擬谷盜（Tribolium castaneum（Herbst））成蟲腸道的細菌群落組成及多樣性研究發現，優勢菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）。王天召等[36]通過Illumina MiSeq高通量測序技術對褐飛虱（Nilaparvata lugens）成蟲腸道的細菌群落組成及多樣性研究發現，優勢菌門包括變形菌門（Proteobacteria）、擬 桿 菌 門（Bacteroidetes）和 厚 壁 菌 門（Firmicutes）。孫博通等[37]采用傳統的微生物培養方法研究了斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲腸道可培養細菌共分離得到10種細菌，其中優勢菌群為形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）。王洪秀等[38]采用傳統的微生物培養方法研究了膜翅目蜜蜂屬（Apis）成蟲蜜蜂腸道可培養腸道細菌發現，優勢菌科是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）。不同的種類的昆蟲，其腸道的優勢菌群也不同，與昆蟲的食物、生存環境和昆蟲種類等因素密切相關[12]。而孫佑赫等[39-40]、王金華等[41]和馬艷芳等[42]分別對普洱市寧洱縣磨黑鎮思茅松毛蟲4齡、5齡、6齡和7齡幼蟲腸道細菌的研究中發現優勢菌屬為分別為短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和腸桿菌屬（Enterobacteer），不同時期思茅松毛蟲腸道細菌隨著昆蟲的生長發育，腸道細菌優勢菌群會有所變化，而同一時期的不同發育狀態的成蟲腸道優勢菌群也不同。

鞘脂單胞菌科細菌生存能力強，能快速分解有機物，其比例與脲酶（一種催化尿素水解成氨和二氧化碳的酶，和生物體內氮代謝密切相關）活性顯著正相關[43]。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）細菌廣泛存在于根際土壤內，能夠降解纖維素，產生消化酶，能夠利用木質素、纖維二糖、幾丁質等芳香化合物進行生長，有助于昆蟲的生長發育[44-46]。雄成蟲在幼蟲階段可能具有消化松香和其它松樹揮發性物質的能力，并且松香有生物毒性，可以抵抗松香內含有的重金屬毒性。鞘氨醇單胞菌屬可以產生胞外多糖，或者吸附在細胞膜表面作為脂多糖（LPS）的O-抗原，在細胞周圍形成莢膜，對腸道會形成保護作用，莢膜形成的疏水表面更益于這些細菌在生態環境中的存活及芳香化物的攝取。泛生菌屬（Pantoea）細菌廣泛存在于土壤、植物、昆蟲中，是一種植物致病菌，但作為昆蟲重要的內共生菌，能夠抵御病原菌的侵害，具有重要的免疫作用[47-50]。胡笑峰等[51]研究發現，歐文氏菌科（Erwiniaceae）細菌能夠降解木質素，有助于昆蟲的消化的作用。雌成蟲在幼蟲階段可能以富含木質素的松木為食物，并且可能分解植物多糖為二糖或單糖，進而獲取能量。叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）細菌能穩定降解類固醇、多環芳烴類物質，產生一種重要的激素降解酶，能夠降解激素，調控蛋白[52-53]。

變形菌是思茅松毛蟲腸道豐度差異性最顯著的菌門，雄成蟲差異性最高的是alpha-變形菌綱，雌成蟲差異性最高的是gamma-變形菌綱。α-變形菌大多都是革蘭氏陰性菌，主要包括了鞘脂單胞菌目等細菌，松毛蟲體內大多是內共生細菌，主要起降解含氮有機物作用[54]；γ-變形菌綱是所知的細菌中種類最多的一綱，包括了歐文氏菌，可以對含碳纖維素進行降解[55]；思茅松毛蟲雌雄成蟲腸道分解食物的側重點有所不同，但是雌成蟲也含有雄蟲相似的菌類，雌成蟲在幼蟲階段不但可以消化含碳纖維，也可以消化含氮物質，因而食譜更廣。研究僅對思茅松毛蟲成蟲的腸道細菌組做了研究，關于腸道細菌的生物學功能等需要做進一步的研究。

4 結論

雄蛾和雌蛾的Shannon指數、Simpson指數、ACE指數、Chao1指數、Coverage指數分別為2.583 5、0.254 4、381.415 1、401.985 6、0.999 7；2.766 3、0.193 9、609.770 2、576.310 0、0.999 7，思茅松毛蟲成蟲腸道細菌群落組成和多樣性豐富。其中，雄蛾和雌蛾的優勢菌為變形菌門（Proteobacteria，雌81.27%/雄81.17%）；在科水平上，雄蛾的優勢菌科是鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，49.16%）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae，19.09%），雌蛾的優勢菌科是歐文氏菌科（Erwiniaceae，34.09%）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae，16.68%）；在屬水平上，雄蛾的優勢菌屬是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，48.09%），雌蛾的優勢菌屬是泛生菌屬（Pantoea，31.58%）。雄蛾腸道中豐度差異顯著性最高的菌群為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria），雌蛾腸道中豐度差異顯著性最高的菌群為γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）。