流動相對液相色譜法測量乳制品中三聚氰胺影響的探究

陳茂姣，鄧燕琴，何娓娓，蘭 寧，張紅梅

四川新希望乳業有限公司洪雅陽平分公司，四川眉山 620360

0 引言

高效液相色譜法因其具有測量精度高、穩定性好、測量結果準確等特點，被廣泛應用在定量檢測中。但檢測結果也受到很多因素的影響[1]，比如儀器的各項參數設置、色譜柱的種類和長短、色譜柱的填充物和孔徑、流動相的比例等。其中流動相的比例對目標物的出峰時間、峰型的良好與否有很大的關系。不適宜的流動相有可能造成雙峰、拖尾峰、峰展寬、保留時間不斷變動、靈敏度不高的問題，檢測出的結果也不可靠，可能會導致假陽性或假陰性。合適的流動相比例可以使目標物的峰型左右對稱，與雜峰分離良好，獲得可靠的試驗結果。本文通過液相色譜儀檢測三聚氰胺的含量[2]，研究不同流動相比例對三聚氰胺檢測結果的影響，從而找出方法中最適宜檢測三聚氰胺的流動相比例。

1 試驗流程

本文使用方法為《GB/T 22388—2008 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中的第一法高效液相色譜法。待測樣品經過三氯乙酸和乙腈的提取后[3]，經陽離子交換固相萃取柱凈化，氮吹后用流動相定容，經有機濾頭過濾后，用高效液相色譜測定，外標法定量。

2 試驗方法

2.1 試驗試劑與材料

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），默克化工技術（上海）有限公司；三氯乙酸（優級純）、氨水（分析純），成都市科隆化學品有限公司；檸檬酸（分析純），福晨（天津）化學試劑有限公司；辛烷磺酸鈉（優級純），成都市科隆化學品有限公司；三聚氰胺標準品（純度≥99.5%），上海安譜實驗科技股份有限公司。

配制離子對試劑緩沖液：準確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉，加入約980 mL水溶解，調節pH至3.0后，定容至1 L備用。

2.2 試驗儀器

高效液相色譜儀[LC-1260（VWD）]，安捷倫科技（中國）有限公司；渦旋振蕩器，上海瀘析實業有限公司；調速多用振蕩器，常州市凱航儀器有限公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；分析天平，上海民橋精密科學儀器有限公司。

2.3 標準曲線

分別移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、5.0 mL濃度為100 mg/L的三聚氰胺標準儲備液于100 mL容量瓶中，用流動相分別定容至刻度線，混勻備用，得到0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L的標準曲線。

標準曲線是使用流動相進行定容的，測試不同流動相比例需要重新配制相應的標準曲線。

2.4 儀器參數

2.4.1 色譜柱

C18柱，4.6×250 mm，5μm，安捷倫科技（中國）有限公司。

2.4.2 參數設置

進樣量：20μL；波長：240nm；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min。

2.4.3 流動相

離子對試劑緩沖液和乙腈按照不同比例混勻。

2.5 具體步驟

稱取2 g（精確至000.1 g）試樣于50 mL離心管中，加入15 mL 2%三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超聲10 min，取出后震蕩10 min，最后6000 r/min離心10 min，離心后的上清液經定性濾紙過濾至25 mL比色管中，用2%三氯乙酸溶液定容至25 mL。取5 mL濾液與5 mL超純水混勻，經固相萃取柱凈化后，用5%的氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，在50 ℃水浴下用氮吹儀吹至近干，最后用1 mL流動相定容，用0.22 μm有機濾頭過濾后上機測定。

每次上機檢測需要測定標準曲線（當前流動相比例定容）、標準曲線的標準點連續測3 次、陰性本底、陰性本底加標，并做三次平行。觀察標準曲線的出峰時間、本底加標的回收率、標準點的峰型與峰面積相對標準偏差。

3 試驗結果

3.1 流動相比例為85:15的檢測結果

離子對試劑緩沖液與乙腈的比例為85:15時，出峰時間為9 min左右，回收率為91.9%~92.0%，但分離度不好，與雜峰有粘連，如表1和圖1所示。

表1 流動相比例為85:15的檢測結果

圖1 流動相比例為85:15的峰型

3.2 流動相比例為88:12時的檢測結果

離子對試劑緩沖液與乙腈的比例為88:12時，出峰時間為12.9 min左右，回收率為79.9%~84.8%，回收率差，且峰型有輕微拖尾，如表2和圖2所示。

表2 流動相比例為88:12的檢測結果

圖2 流動相比例為88:12的峰型

3.3 流動相比例為90:10時的檢測結果

離子對試劑緩沖液與乙腈的比例為90:10時，出峰時間為17.3 min左右，回收率為92.1%~96.2%，分離度較好，峰型左右對稱，如表3和圖3所示。

表3 流動相比例為90:10的檢測結果

圖3 流動相比例為90:10的峰型

3.4 流動相比例為92:8時的檢測結果

離子對試劑緩沖液與乙腈的比例為92:8時，出峰時間為24.5 min左右，回收率為82.5%~86.2%，但分離度不好，雜峰較多，如表4和圖4所示。

表4 流動相比例為92:8的檢測結果

圖4 流動相比例為92:8的峰型

3.5 流動相比例為95:5時的檢測結果

離子對試劑緩沖液與乙腈的比例為95:5時，出峰時間為40.7 min左右，出峰時間太長，回收率為89.3%~109.9%，回收率不穩定，與雜峰分離度不好，峰拖尾，如表5和圖5所示。

表5 流動相比例為95:5的檢測結果

圖5 流動相比例為95:5的峰型

4 結論

流動相中離子對試劑緩沖液與乙腈的比例對檢驗結果起著至關重要的作用。乙腈含量高時，目標峰出峰時間相對短一些，能提高檢測速度，乙腈含量低時，目標峰出峰時間相對長一些，檢測時間較長。選擇流動相比例時要綜合考慮目標峰保留時間的長短，與雜峰和溶劑峰的分離度，峰型，是否拖尾，目標物的回收率等情況[3]。流動相比例為92:8與95:5時，目標峰出峰時間較遲，會導致檢測速度過慢。比例為92:8時雜峰較多，與溶劑峰分離度不好，回收率為82.5%~86.2%。流動性比例90:10時保留時間為17.3 min左右，保留時間合適，且回收率較好，分離度好，峰型左右對稱，為最佳比例。