基于乳腺癌化療-光動力聯合治療的負載紫杉醇白蛋白納米給藥系統的制備及其體外評價

亓文霞，王勝蘭，楊 桁，高 科，王云騰，孫鈺迪，趙 峰，張加余，張 靜

·藥劑與工藝·

基于乳腺癌化療-光動力聯合治療的負載紫杉醇白蛋白納米給藥系統的制備及其體外評價

亓文霞，王勝蘭，楊 桁，高 科，王云騰，孫鈺迪，趙 峰，張加余，張 靜*

濱州醫學院藥學院 國家中醫藥管理局方劑效應與臨床評價重點研究室，山東 煙臺 264003

以光敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）修飾人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）為載體，負載抗腫瘤藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）后構建納米給藥系統PTX@HSA-Ce6，以實現腫瘤“化療-光動力”聯合治療，改善乳腺癌治療效果。共價結合法制備HSA-Ce6，紅外光譜、紫外-可見吸收光譜和熒光光譜進行表征；自組裝法制備載藥納米粒PTX@HSA-Ce6，對其粒徑分布、表面ζ電位、形貌及穩定性進行表征，研究其藥物負載和釋放行為；利用乳腺癌MCF-7細胞模型考察PTX@HSA-Ce6的活性氧產生、細胞攝取及體外抗腫瘤效果。當HSA與Ce6投料比為1∶10時，制備得到的PTX@HSA-Ce6呈規整的球形，平均粒徑為（147.4±0.9）nm，ζ電位為（?15.2±0.6）mV，具有良好的穩定性。PTX@HSA-Ce6可有效負載紫杉醇，具有pH敏感性藥物緩釋效果。PTX@HSA-Ce6可被MCF-7細胞快速、持續攝取，激光照射下可在胞內產生活性氧，與紫杉醇發揮聯合抗腫瘤作用。PTX@HSA-Ce6可實現對Ce6和紫杉醇的共載和胞內遞送，發揮化療-光動力治療聯合抗腫瘤作用，有利于改善乳腺癌的治療效果。

紫杉醇；二氫卟吩e6；人血清白蛋白；納米給藥系統；化療；光動力治療；乳腺癌；共價結合法；自組裝法

乳腺癌已超越肺癌，成為世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤，發病率和死亡率位列全球女性惡性腫瘤首位，在我國女性惡性腫瘤發病率中也位列首位[1-2]。化療是乳腺癌臨床治療中的主要藥物治療手段，但化療藥物往往存在溶解性差、非特異性分布導致全身不良反應等缺陷，治療效果不理想[3]。紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紅豆杉中提取的一種二萜類天然次生代謝產物，可通過促進微管聚合和抑制解聚來保持微管蛋白穩定，從而抑制腫瘤細胞的有絲分裂并促進凋亡，廣泛用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌等惡性腫瘤的治療[4]。然而，紫杉醇存在水溶性差、非特異性體內分布、易產生耐藥等缺陷，作為單一治療手段往往效果不佳，且毒副作用大，限制了其臨床應用。目前，大量納米給藥系統被開發并應用于紫杉醇的遞送中，不僅可以改善紫杉醇的溶解度，提高其靶向性和生物利用度，而且為紫杉醇與其他治療手段的聯合應用提供了契機，在乳腺癌治療中有望發揮重要作用[5-7]。

研究證實，聯合治療可顯著提高單一化療藥物的治療效果。將化療與光動力治療相結合的腫瘤診療一體化技術，是一種極有潛力的腫瘤聯合治療策略[8]。光動力治療是腫瘤輔助治療的重要手段，利用光敏劑在特定波長激光照射下產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），通過激活細胞凋亡的死亡受體途徑和線粒體途徑、參與自噬性細胞死亡等方式發揮抗腫瘤作用，具有侵襲性小、靶向性好、成本低等優點[9]。然而，光動力治療受到腫瘤缺氧微環境中氧含量不足的制約，且隨著治療的進行會造成腫瘤缺氧加劇，因此作為單一治療手段不僅難以根除腫瘤，還可能增加腫瘤細胞的抗性[10]。研究表明，利用納米給藥系統對光敏劑和化療藥物進行共傳遞，有望發揮光動力治療與化療的聯合抗腫瘤作用，從而彌補單一治療方式的應用缺陷，還可以通過生物成像來輔助治療，在腫瘤治療領域展示出獨特的優勢[11]。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）具有生物相容性好、免疫原性低、化學穩定性高、半衰期長等優點，是一種理想的天然大分子載體材料[12-13]。本研究以HSA為載體材料，與光敏劑二氫卟吩e6（chlorin e6，Ce6）共價結合后，通過自組裝法負載紫杉醇，構建共載Ce6和紫杉醇的納米給藥系統PTX@HSA-Ce6，以期同時實現乳腺癌的化療-光動力聯合治療，改善乳腺癌的治療效果，如圖1所示。

圖1 PTX@HSA-Ce6的制備與“化療-光動力治療”聯合抗腫瘤作用示意圖

1 儀器與材料

1.1 儀器

Nano ZS90納米激光粒度分析儀，英國Malvern公司；JEM-1400透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；高效液相色譜，美國Thermo Fisher Scientific公司；TGA/DSC 3+熱重及同步熱分析儀，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計，日本日立公司；PerkinElmer Frontier傅里葉變換紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機，德國Christ公司；Leica TCS SPE激光掃描共聚焦顯微鏡，德國Leica公司；Tecan Infinite Pro全波長多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；BD FACS Canto II流式細胞儀，美國BD公司；Bugbox M微需氧培養箱，英國Ruskinn公司；660 nm光纖耦合激光器，長春鐳仕光電科技有限公司。

1.2 試劑

HSA（質量分數＞96%，批號SLCH5923），美國Sigma-Aldrich公司；紫杉醇（質量分數＞99%，批號J2028191）、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽［1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］和-羥基琥珀酰亞胺（-hydroxysuccinimide，NHS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Ce6（質量分數＞90%，批號N1127A）和單線態氧綠色熒光探針（singlet oxygen sensor green，SOSG），大連美侖生物技術有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美國Gibco公司；Hoechst 33342和胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；Dulbecco’s modified eagle medium（DMEM）培養基，美國Hyclone公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）ROS檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；乙腈，色譜純，天津福晨化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑公司。

1.3 細胞

人乳腺癌細胞株MCF-7細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 HSA-Ce6的合成與表征

2.1.1 HSA-Ce6的合成 參照文獻方法[14-15]，稱取20 mg HSA溶于9 mL pH 8.0的PBS（0.1 mol/L，NaCl 0.05 mol/L）中。稱取一定量Ce6（HSA與Ce6物質的量比分別為1∶5、1∶10、1∶20）溶于1 mL DMSO中，加入NHS和EDC（Ce6、NHS、EDC的物質的量比為1∶4.5∶4.5），室溫下避光攪拌活化24 h。將活化后的Ce6溶液滴加入HSA溶液中，攪拌反應24 h，于去離子水中透析（截留相對分子質量14 000）48 h。將透析液5000 r/min離心10 min（離心半徑12.3 cm），取上清液冷凍干燥，分別制備得到不同比例載體材料HSA-Ce6（1∶5）、HSA-Ce6（1∶10）和HSA-Ce6（1∶20）。

2.1.2 HSA-Ce6的表征 利用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）對HSA-Ce6的結構進行表征，利用熒光分光光度計檢測其熒光光譜。利用紫外分光光度法測定HSA-Ce6溶液中Ce6的質量濃度，利用BCA法測定其中HSA的質量濃度，根據以下公式計算Ce6的偶聯度（）[16]。

＝Ce6/HSA

Ce6為溶液中Ce6的質量，HSA為溶液中HSA的質量

（1）HSA-Ce6的FT-IR表征：HSA、Ce6和HSA-Ce6的FT-IR譜圖如圖2所示。HSA的FT-IR光譜給出了蛋白質類的共有吸收峰，包括3289、1658、1546 cm?1處酰胺結構的特征吸收，2960、2915 cm?1處甲基的不對稱伸縮振動吸收峰；Ce6的FT-IR光譜顯示甲基（2964 cm?1）和羧基中C＝O（1711 cm?1）的特征吸收，以及烯氫的彎曲振動峰（955、895 cm?1）[17]。不同投料比的HSA-Ce6樣品的FT-IR光譜均給出蛋白質的特征吸收，且1711 cm?1處羰基吸收大大減弱，HSA-Ce6（1∶5）在951、860 cm?1處，HSA-Ce6（1∶10）在944、859 cm?1處，HSA-Ce6（1∶20）在945、858 cm?1處均出現烯氫的彎曲振動峰，證實Ce6與HSA成功偶聯。

（2）HSA-Ce6的紫外-可見光譜與熒光光譜表征：HSA-Ce6的紫外-可見光譜與熒光光譜如圖3所示。由圖3-A可見，HSA在280 nm處有最大吸收波長，Ce6在404、660 nm處出現特征吸收峰。HSA-Ce6（1∶5）、HSA-Ce6（1∶10）和HSA-Ce6（1∶20）的譜圖中均可明顯看到Ce6和HSA的特征峰，與文獻報道一致[18]。隨著Ce6投料量的增加，引入HSA主鏈中的Ce6數目進一步增加，利用紫外分光光度法測得HSA-Ce6（1∶5）、HSA-Ce6（1∶10）和HSA-Ce6（1∶20）中Ce6的偶聯度分別為34.6、59.3、72.7 μg/mg。由圖3-B可見，HSA-Ce6和Ce6在660 nm處均有明顯的熒光發射峰，表明HSA與Ce6的偶聯不會改變Ce6的光吸收特性。HSA-Ce6的熒光強度隨Ce6投料量的增加而降低，這可能是由于二者偶聯使Ce6分子間的重疊增加，間距變小，同時局部濃度增加導致Ce6熒光淬滅[19]。

圖2 HSA (A)、Ce6 (B)、HSA-Ce6 (1∶5, C)、HSA-Ce6 (1∶10, D)、HSA-Ce6 (1∶20, E)的FT-IR圖

圖3 HSA-Ce6的紫外-可見吸收光譜(A) 及熒光光譜(B)

2.2 載藥納米粒PTX@HSA-Ce6的制備與表征

2.2.1 PTX@HSA-Ce6的制備 利用紫杉醇與HSA疏水結構域之間的疏水相互作用誘導HSA-Ce6自組裝形成載藥納米粒PTX@HSA-Ce6[20]。稱取10 mg HSA-Ce6（1∶5、1∶10、1∶20）溶于10 mL pH 8.0的PBS（0.1 mol/L，NaCl 0.05 mol/L）中，稱取2 mg紫杉醇溶于1 mL無水乙醇中。邊攪拌邊將紫杉醇的無水乙醇溶液滴加至HSA-Ce6溶液中，反應液于去離子水中透析（截留相對分子質量14 000）48 h，將透析液5000 r/min離心（離心半徑12.3 cm）10 min，上清液即為PTX@HSA-Ce6懸液。

2.2.2 PTX@HSA-Ce6的表征 利用納米激光粒度儀測定PTX@HSA-Ce6的粒徑分布、表面ζ電位及多分散系數（polydispersity index，PDI），利用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察其形貌。分別取紫杉醇、HSA-Ce6、PTX@HSA-Ce6以及紫杉醇與HSA-Ce6的混合物，在25～300 ℃進行差示熱量掃描（differential scanning calorimetry，DSC）分析[21]。將PTX@HSA-Ce6分別于37 ℃、含10% FBS的DMEM完全培養基和4 ℃、pH 7.4 PBS中孵育7 d，檢測其粒徑分布與表面ζ電位變化情況，考察其體內穩定性和儲存穩定性。

2.2.3 PTX@HSA-Ce6的包封率與載藥量測定 取1 mL PTX@HSA-Ce6懸液，加入9 mL乙腈，超聲提取納米粒中的紫杉醇，12 000 r/min離心（離心半徑12.3 cm）10 min，取上清液進樣HPLC進行紫杉醇含量測定[22]。根據以下公式計算PTX@HSA-Ce6的包封率和載藥量。

包封率＝NPs/紫杉醇

載藥量＝NPs/總

NPs為PTX@HSA-Ce6中紫杉醇的質量，紫杉醇為紫杉醇的投藥量，總為1 mL PTX@ HSA-Ce6懸液冷凍干燥后的總質量

載藥納米粒PTX@HSA-Ce6的粒徑分布、多分散系數（polydispersity index，PDI）、表面ζ電位、包封率和載藥量檢測結果如表1和圖4所示。隨著Ce6投料量的增加，PTX@HSA-Ce6的平均粒徑從（138.6±3.9）nm增加至（169.5±7.9）nm，均小于200 nm，有利于借助實體瘤的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應富集于腫瘤組織周圍[23]。PTX@HSA-Ce6的包封率和載藥量隨Ce6的投料量的增加而增加，這可能與Ce6偶聯度增加導致HSA疏水性增強有關。由于體系pH值高于HSA等電點，因此PTX@HSA-Ce6表面為負電性，有利于減少網狀內皮系統的非選擇性清除，且ζ電位絕對值隨Ce6投料量的增加而增大，這可能與HSA表面氨基被Ce6取代有關。研究表明，Ce6易因誘導聚集而導致熒光猝滅，制劑中紫杉醇含量增加可能促進Ce6聚集，影響光動力治療效果[19]。因此，為保證PTX@HSA-Ce6能夠發揮化療-光動力聯合治療作用，結合熒光光譜檢測結果，選擇HSA-Ce6（1∶10）用于后續載藥納米粒的制備和實驗研究。

表1 PTX@HSA-Ce6的表征

Table 1 Characterization of PTX@HSA-Ce6

投料比（HSA∶Ce6）平均粒徑/nmPDIζ電位/mV包封率/%載藥量/% 1∶5138.6±3.90.206±0.030?13.9±0.736.77.8 1∶10147.4±0.90.229±0.040?15.2±0.646.49.5 1∶20169.5±7.90.258±0.030?19.1±1.153.810.2

圖4 PTX@HSA-Ce6的粒徑分布(A) 和ζ電位(B)

TEM觀察PTX@HSA-Ce6的形貌如圖5-A所示。PTX@HSA-Ce6呈規整的球形，粒徑為100～150 nm。HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6在水中均顯示出良好的溶解性和分散性，而游離Ce6幾乎不溶，表明HSA與Ce6偶聯后顯著改善了Ce6的溶解性（圖5-B）。在不同條件下保存7 d，PTX@HSA-Ce6的粒徑以及ζ電位略有改變，但波動范圍較小（PBS中粒徑為142.8～178.9 nm，ζ電位為?14.1～?19.2 mV；含10% FBS的DMEM中粒徑為138.4～192.0 nm，ζ電位為?13.4～?18.1 mV），證實其具有較好的儲存穩定性和體內穩定性（圖5-C、D）。由圖5-E可見，HSA-Ce6與紫杉醇物理混合后在220、237 ℃處出現紫杉醇的熔融吸收峰和分解放熱峰，表明紫杉醇為結晶狀態，而PTX@HSA-Ce6的DSC曲線與HSA-Ce6相似，未出現熔融吸收峰和分解放熱峰，表明紫杉醇成功負載于PTX@HSA-Ce6中[24]。

2.3 PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放研究

分別配制含0.2%聚山梨酯80的不同pH的PBS緩沖液作為釋放介質，考察PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放情況[25]。取3 mL PTX@HSA-Ce6懸液置于透析袋（截留相對分子質量14 000）中，轉移至含30 mL不同釋放介質的棕色瓶中，37 ℃恒溫振蕩，分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h移出3 mL釋放介質，并補加等體積空白釋放介質。利用HPLC測定移出的釋放介質中紫杉醇含量，根據以下公式計算PTX@HSA-Ce6的累積藥物釋放率（），繪制藥物釋放曲線。

0為PTX@HSA-Ce6中紫杉醇的總量，為釋放介質的總體積，為取樣次數，V為時移出釋放介質的體積，C為時釋放介質中紫杉醇的質量濃度

分別模擬正常生理環境（pH 7.4）、腫瘤細胞外環境（pH 6.5）和腫瘤細胞內溶酶體環境（pH 5.0）考察PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放情況。如圖6所示，PTX@HSA-Ce6在不同pH條件下均為8 h內釋放速率較快，而后趨于平緩。PTX@HSA-Ce6的釋藥量隨體系pH的降低而增加，72 h時pH 5.0條件下的累積釋放率（56.2%）顯著高于pH 7.4（33.6%）和pH 6.5（46.7%）下的累積釋放率，這可能與酸性條件下HSA質子化導致紫杉醇與HSA-Ce6間的靜電和疏水相互作用減弱有關[26]。這一釋放行為將有利于提高PTX@HSA-Ce6在遞送過程中的穩定性，加快PTX@HSA-Ce6被腫瘤細胞攝取后的藥物釋放，有利于提高紫杉醇的治療效果。

圖6 PTX@HSA-Ce6的體外藥物釋放曲線

2.4 PTX@HSA-Ce6的光化學性質研究

利用SOSG探針考察PTX@HSA-Ce6在660 nm激光照射下的ROS生成情況[27]。向PTX@HSA-Ce6懸液中加入SOSG溶液（終濃度為1 μmol/L），660 nm激光照射后利用全波長多功能酶標儀（Ex＝489 nm，Em＝528 nm）測定各樣品的熒光強度，考察不同激光照射時間、照射強度下ROS的產生情況。利用SOSG探針檢測PTX@HSA-Ce6的ROS生成情況，結果如表2所示。可見，ROS的產量隨著PTX@HSA-Ce6中Ce6濃度的提高而增加，具有一定的濃度相關性。隨著照射時間和照射強度的增加，體系中的熒光強度逐漸增強，該結果表明PTX@ HSA-Ce6生成ROS具有一定的照射時間和強度相關性[27-28]。在實驗設定的參數范圍內，50 mW/cm2照射4 min時PTX@HSA-Ce6產生的ROS量最高，因此選擇該照射條件進行后續實驗研究。

2.5 溶血實驗

利用紅細胞溶血實驗考察PTX@HSA-Ce6的體外血液相容性，初步評價其用于靜脈給藥的安全性。參照文獻方法[29]，取新鮮兔血用生理鹽水處理后配成2%的紅細胞懸液。分別取不同濃度的HSA-Ce6溶液或PTX@HSA-Ce6懸液與紅細胞懸液等體積混合，以蒸餾水為陽性對照，生理鹽水為陰性對照，37 ℃孵育2 h。2500 r/min離心（離心半徑15.7 cm）10 min，取上清液于545 nm處測定其吸光度（）值，根據以下公式計算溶血率。

表2 660 nm光照下PTX@HSA-Ce6的ROS產生

Table 2 ROS generation of PTX@HSA-Ce6 under 660 nm light irradiation

Ce6質量濃度/(μg?mL?1)照射時間/min功率密度/(mW?cm?2)平均熒光強度 0.0084501 932.3±537.0 0.0804505 990.7±249.3 0.80045029 025.0±845.2 0.80015015 641.0±3 393.7 0.80025023 237.0±2 477.8 0.8004513 391.3±317.1 0.80042024 215.3±805.3

溶血率＝(樣品－nc)/(pc－nc)

樣品為樣品組值，nc為陰性對照值，pc為陽性對照值

通過體外紅細胞溶血實驗考察載體材料HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6的溶血率，結果如圖7所示。在實驗設定的質量濃度范圍內，HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6的溶血率隨質量濃度增加略有上升，但均低于5%，表明其用于靜脈給藥具有良好的生物安全性。

圖7 HSA-Ce6和PTX@HSA-Ce6的溶血率

2.6 細胞內ROS檢測

將MCF-7細胞以2×104個/皿接種于激光共聚焦培養皿中，分別置于20% O2常氧培養箱或2% O2微需氧培養箱中培養過夜。將各皿中培養液更換為不同濃度的PTX@HSA-Ce6懸液，原培養條件下繼續孵育4 h。棄去皿中溶液，PBS漂洗后加入1 mL DCFH-DA溶液（終濃度為10 μmol/L），繼續孵育30 min。660 nm、50 mW/cm2激光照射4 min后，PBS漂洗，置于激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）下觀察，考察細胞內ROS生成情況。

細胞內ROS的產生是決定光動力治療效果的重要指標，PTX@HSA-Ce6在660 nm激光照射下的胞內ROS產生情況如圖8所示。未經任何處理組Control（L?）和僅經激光照射組Control（L+）細胞內均未觀察到熒光產生，未經激光照射的PTX@ HSA-Ce6暗處理組PTX@HSA-Ce6（L?）細胞內僅見微弱的點狀熒光。激光照射后，PTX@HSA-Ce6（L+）胞內熒光強度明顯增加，且熒光強度隨PTX@ HSA-Ce6濃度的增加而增加。常氧條件下激光照射后胞內的熒光強度高于低氧條件下的熒光強度，但低氧條件下PTX@HSA-Ce6仍能產生一定量ROS，表明在腫瘤內部缺氧微環境中PTX@HSA-Ce6仍有望通過光動力治療與化療發揮聯合抗腫瘤作用[30]。

圖8 MCF-7細胞在光照(L+) 和暗處理(L?) 下ROS生成的CLSM圖像

2.7 體外細胞攝取研究

分別利用CLSM和流式細胞儀（flow cytometry，FCM）研究MCF-7細胞對PTX@HSA-Ce6的體外攝取情況。

2.7.1 CLSM觀察 將MCF-7細胞以2×104個/皿接種于激光共聚焦培養皿中，CO2培養箱中孵育過夜。將各皿中培養液更換為不同濃度的PTX@HSA- Ce6懸液，繼續培養一定時間。棄去皿中溶液，PBS漂洗，加入4%多聚甲醛溶液固定，Hoechst 33342溶液染色15 min，PBS漂洗后置于CLSM下觀察。

2.7.2 FCM檢測 將MCF-7細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，CO2培養箱中孵育過夜。將各孔中培養液更換為不同濃度的PTX@HSA-Ce6懸液，繼續培養一定時間。棄去各孔中溶液。PBS漂洗后胰酶消化，1000 r/min離心（離心半徑15.7 cm）5 min后將細胞重懸于0.5 mL PBS中，進樣FCM檢測。Ce6的二氫卟吩環結構可產生強熒光信號，可實現PTX@HSA-Ce6的近紅外熒光成像。利用CLSM和FCM研究了MCF-7細胞對PTX@HSA- Ce6的體外細胞攝取情況，如圖9所示。CLSM觀察可見，MCF-7細胞對PTX@HSA-Ce6的攝取具有明顯的濃度相關性（圖9-A）。孵育1 h后，在細胞質中即可觀察到微弱的熒光，細胞質中熒光強度隨孵育時間的延長而增加，表現出一定的時間相關性（圖9-B）。FCM檢測結果與CLSM觀察結果一致（圖9-C、D），證實PTX@HSA-Ce6可被MCF-7細胞快速、持續攝取，并在細胞質中大量聚集，有助于促進藥物和光敏劑的跨膜轉運，為發揮化療和光動力治療的聯合抗腫瘤作用提供了基礎。

A-不同質量濃度PTX@HSA-Ce6與MCF-7細胞作用2 h的CLSM照片 B-PTX@HSA-Ce6（Ce6質量濃度4 μg?mL?1）與MCF-7細胞作用不同時間的CLSM照片 C-不同質量濃度PTX@HSA-Ce6與MCF-7細胞作用2 h的FCM檢測結果 D-PTX@HSA-Ce6（Ce6質量濃度4 μg?mL?1）與MCF-7細胞作用不同時間的FCM檢測結果

2.8 體外細胞毒性實驗

利用MTT法研究常氧和低氧條件下PTX@ HSA-Ce6對MCF-7的體外細胞毒性。將MCF-7細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，分別置于20% O2的常氧培養箱或2% O2的微需氧培養箱中培養過夜。將各孔中的培養液更換為不同質量濃度的HSA-Ce6溶液、PTX@HSA-Ce6懸液或游離紫杉醇，以培養液為陰性對照，原培養條件下繼續培養4 h。激光照射組用660 nm、50 mW/cm2激光照射4 min，其他組不做處理，繼續培養24 h。各孔中加入MTT繼續培養4 h后，棄去各孔中溶液，加入DMSO 150 μL充分溶解甲臜，于酶標儀490 nm處測定各孔的值，根據公式計算MCF-7細胞的存活率。

細胞存活率＝樣品/nc

樣品為樣品組值，nc為陰性對照值

利用MTT法對PTX@HSA-Ce6對MCF-7細胞的體外細胞毒性進行研究，結果如圖10所示。可見，暗處理時，不同條件下各質量濃度HSA-Ce6（L?）作用于MCF-7細胞后細胞的存活率均高于90%，表明HSA-Ce6具有良好的生物相容性。游離紫杉醇在常氧和低氧條件下對MCF-7細胞的體外細胞毒性隨質量濃度的增加而增加。當Ce6質量濃度低于0.08 μg/mL時，激光照射后HSA-Ce6（L+）和PTX@HSA-Ce6（L+）的細胞毒性與暗處理組未見顯著差異，低氧、常氧2種條件下HSA-Ce6（L+）的細胞毒性之間也未見顯著差異，這可能與低質量濃度下激光照射后，Ce6產生的ROS含量不足有關[19]。當Ce6質量濃度為0.80 μg/mL時，HSA-Ce6（L+）和PTX@HSA-Ce6（L+）的細胞毒性較暗處理組顯著增加，且常氧下HSA-Ce6（L+）的細胞毒性顯著高于低氧下HSA-Ce6（L+）的細胞毒性（＜0.01），表明當Ce6質量濃度足夠高時，產生的ROS可通過PDT發揮抗腫瘤作用[31]。

同時，無論低氧還是常氧條件下，PTX@HSA-Ce6（L+）的細胞毒性均顯著高于紫杉醇和HSA-Ce6（L+）的細胞毒性（＜0.01），表明激光照射下PTX@HSA-Ce6表現出較單一使用紫杉醇和單一使用HSA-Ce6光動力治療更為顯著的MCF-7細胞增殖抑制效果，有望通過化療-光動力聯合治療改善乳腺癌的治療效果。

*P＜0.05 **P＜0.01

3 討論

化療是乳腺癌臨床治療中的主要藥物治療手段，光動力治療是腫瘤輔助治療的重要手段，但二者作為單一治療方式應用于乳腺癌治療效果均不理想。由于化療藥物產生細胞毒作用的機制與光動力治療產生ROS導致細胞死亡的機制有很大差異，因此通過構建納米給藥系統將光敏劑和化療藥物共傳遞到腫瘤組織，有望通過化療與光動力治療二者互補來實現高效、低毒的腫瘤聯合治療，具有重要的研究和應用價值[32]。

本研究發現，當Ce6與HSA物質的量比為10∶1時制備得到的PTX@HSA-Ce6具有較高的包封率和載藥量，且平均粒徑為（147.4±0.9）nm，易于通過EPR效應富集于腫瘤組織周圍，適合于作為Ce6和紫杉醇的共傳遞體系，有利于實現腫瘤的化療-光動力聯合治療，進而改善乳腺癌的治療效果[26]。

PTX@HSA-Ce6可以被MCF-7細胞快速、持續攝取，能夠實現Ce6和紫杉醇的胞內遞送。研究表明腫瘤細胞由于代謝異常及對特定蛋白的自身調節而形成了獨特的乏氧、高還原的弱酸性微環境[33]。PTX@HSA-Ce6在模擬腫瘤細胞內溶酶體環境的酸性條件下紫杉醇釋放率顯著高于模擬正常生理環境的中性條件下的釋放率，表明PTX@HSA-Ce6攜帶藥物進入腫瘤細胞內部后可以促進藥物的釋放，同時降低藥物在遞送過程中的滲漏，減少對正常組織的損傷。

激光照射下，Ce6通過產生大量ROS不僅可以直接殺傷腫瘤細胞，促進腫瘤細胞凋亡，還可能破壞溶酶體膜結構，從而實現藥物的溶酶體逃逸，改善腫瘤治療效果[33-34]。腫瘤乏氧微環境往往導致光敏劑利用率低，激光照射后低氧條件下PTX@HSA-Ce6產生的胞內ROS明顯低于常氧下產生的胞內ROS水平，作為單一治療方式效果不理想。與單一使用游離紫杉醇進行化療和單一使用HSA-Ce6進行光動力治療相比，激光照射后PTX@HSA-Ce6在體外細胞毒性實驗中表現出了更為顯著的MCF-7細胞增殖抑制效果，初步證實PTX@HSA-Ce6用于乳腺癌化療-光動力治療的可行性和應用潛力，為乳腺癌的靶向聯合治療提供了一種新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andevaluation of human serum albumin nano-drug delivery system loaded with paclitaxel for chemo-photodynamic combined therapy of breast cancer

QI Wen-xia, WANG Sheng-lan, YANG Heng, GAO Ke, WANG Yun-teng, SUN Yu-di, ZHAO Feng, ZHANG Jia-yu, ZHANG Jing

Key Laboratory of Prescription Effect and Clinical Evaluation of State Administration of Traditional Chinese Medicine of China, School of Pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China

A paclitaxel (PTX)-loaded nano-drug delivery system based on chlorin e6 (Ce6)-conjugated human serum albumin (HSA) was prepared for chemo-photodynamic combined therapy of breast cancer to improve therapeutic efficacy.HSA-Ce6 conjugates were prepared by covalent coupling method, and their FT-IR spectra, UV-vis absorption spectra and fluorescence spectra were analyzed. Paclitaxel-loaded HSA-Ce6 nanoparticles (PTX@HSA-Ce6) were prepared by self-assembling and their particle distribution, ζ potential, morphology and stability were characterized. The drug loading and release profiles of PTX@HSA-Ce6 were examined. Theintracellular reactive oxygen species (ROS) generation, cellular uptake and cytotoxicity of PTX@HSA-Ce6 were evaluated on human breast cancer MCF-7 cells.PTX@HSA-Ce6 prepared with a HSA/Ce6 molar ratio of 1∶10 displayed uniformly spherical shape and good stability with a mean particle size of (147.4 ± 0.9) nm and ζ potential of (?15.2 ± 0.6) mV. PTX@HSA-Ce6 could efficiently load paclitaxel and showed sustained drug release behaviors with pH-sensitivity. PTX@HSA-Ce6 could be rapidly and continuously taken up by MCF-7 cells, and generated intracellular ROS after laser irradiation. MTT assay indicated that PTX@HSA-Ce6 exhibited significantly higher inhibitory effect on theproliferation of MCF-7 cells compared with the single treatment of paclitaxel or HSA-Ce6.PTX@HSA-Ce6 could facilitate the co-loading and intracellular delivery of Ce6 and paclitaxel, therefore enhance the therapeutic efficacy of breast cancer by chemo-photodynamic combined therapy.

paclitaxel; chlorin e6; human serum albumin; nano-drug delivery system; chemotherapy; photodynamic therapy; breast cancer; covalent coupling; self-assembling

R283.6

A

0253 - 2670(2022)04 - 0993 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.005

2021-09-08

國家自然科學基金資助項目（81703391）；山東省自然科學基金重點項目（ZR2020KB015）；山東省自然科學基金項目（ZR2021MC091）；山東省青創人才引育團隊—中藥復雜體系作用模式解析創新研究團隊項目（10073004）；山東省大學生創新創業訓練計劃（S202010440063）；山東省大學生創新創業訓練計劃（S202110440055）

亓文霞（1995—），女，碩士研究生，從事藥物新劑型研究。E-mail: 18766572383@163.com

張 靜，副教授，從事納米給藥系統的構建與應用研究。E-mail: jing0126@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]