基于“炒炭存性”理論研究炮制工藝對地榆抑菌功效的影響

顧 薇，姚俊宏，陸夢夢，蘇 曼，鄒俊清，蔡徐藝，趙宏宇，宋金云，葛 暢，李 健，童黃錦，陳 軍1, *

基于“炒炭存性”理論研究炮制工藝對地榆抑菌功效的影響

顧 薇1, 2, 3，姚俊宏1, 4，陸夢夢2，蘇 曼5，鄒俊清2，蔡徐藝2，趙宏宇6，宋金云6，葛 暢7，李 健2，童黃錦8*，陳 軍1, 2*

1. 南京中醫藥大學江蘇省中醫外用藥開發與應用工程研究中心，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 3. 江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210023 4. 南京中醫藥大學實驗動物中心，江蘇 南京 210023 5. 連云港市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 連云港 222000 6. 南京中醫藥大學附屬南京醫院（南京市第二醫院）臨床科研中心，江蘇 南京 210009 7. 南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京 210023 8. 南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院藥學部，江蘇 南京 210028

從藥效與灰化2個角度闡釋“炒炭存性”原理，并優選地榆炒炭工藝及探討炮制質量標志物（quality marker，Q-Marker）與灰化臨界點參數。考察炒炭溫度、時間對地榆炮制品外觀性狀、提取物得率、指標性成分、金黃色葡萄球菌抑制效果的影響，以此優選炮制工藝。隨炒炭程度增加，地榆炭提取物中沒食子酸含量先增后減，鞣花酸一直增加。地榆在抗菌效果方面炮制增效，從而闡釋“炒炭存性”；地榆炭對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與提取物中沒食子酸的含量呈較強正向相關性。地榆炭提取物得率與提取物中鞣花酸含量呈極強的反向相關性（＝?0.964 03），地榆炭提取物得率突然下降時，飲片質地開始出現脆化、灰化現象。獲得的最優地榆炒炭工藝：在250 ℃溫度條件下炒炭6 min，此時提取物得率約30%，沒食子酸在提取物［（46.41±0.06）μg/mg］和飲片中［（14.20±0.02）μg/mg］含量相較于其他炮制條件最高。提出用沒食子酸含量指導地榆炒炭工藝，用提取物得率控制灰化臨界點的研究思路，并優化了基于抑菌效應的地榆炮制工藝。

地榆；炮制；炒炭存性；抑菌；質量標志物；沒食子酸；鞣花酸；藥效；灰化

地榆為薔薇科地榆屬植物地榆L.或長葉地榆L. var.(Bert.) Yü et Li的干燥根。地榆炭為地榆照炒炭法炮制所得的炮制品，其性微寒，味苦、酸、澀，歸肝、大腸經，具涼血止血、解毒斂瘡的功效[1]。《中國藥典》2020年版對地榆炒炭程度的要求為“表面焦黑色、內部棕褐色”，尚無量化指標、炮制參數的限定，這就難以保證炭藥質量的均一性和穩定性，經常出現同一種炭藥的臨床療效或研究結果有差異甚至截然不同，如地榆炒炭后鞣質含量增加[2-4]或減少[5]，能促進血液凝固的Ca+濃度增加[6]或減少[7]，炒炭后止血作用增強[3]或沒有影響[8]都有報道。由此，根據藥效優化地榆炒炭工藝，建立藥效相關炮制指標，為臨床提供優質且穩定的地榆炭飲片成為了亟待解決的問題。

地榆炒炭能顯著增強止血功效[3]，然而傳統炮制理論要求“炒炭存性”，所存之性即為原藥材的固有特性，現代研究表明地榆可用于治療多種過敏性皮膚病[9]，具有抗炎、抗菌[10]活性，其對金黃色葡萄球菌[11-13]、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[14-16]、白色念珠菌[11,13]、大腸桿菌[11-13,17]、綠膿桿菌[11]、銅綠假單胞菌[12-13]、枯草芽孢桿菌[12]、蠟狀芽孢桿菌[13]、紅色毛癬菌[18]、嗜水氣單胞菌[19]的抗菌活性在幾十味抗菌中藥中處于前列，與公認的抑菌中藥苦參相當或更優[11,17]。同時，地榆具有極為廣譜的抑菌譜[10,15,20-29]，包括對多種臨床耐藥菌株的抗菌活性[14-16,30]。根據“炒炭存性”理論，地榆炭同樣可能是一類廣譜且顯著的抗菌中藥，但鮮有這方面的研究報道[31]。

有研究指出地榆炭對大腸桿菌和痢疾桿菌的抑制作用強于生地榆[32]；課題組前期研究結果也表明，地榆炭對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、紅色毛癬菌均具顯著的抑制作用，且優于生地榆[18,33]。然而，地榆“炒炭存性”所存之性是否包括其優異的抗菌表現？為存性服務的炒炭工藝是什么？反映炮制工藝的質量標志物（quality marker，Q-Marker）是什么？同時，張仲景在《傷寒雜病論》中首次提出炭藥“燒灰存性，勿令太過”，表明了中藥制炭的限度，即要存性，“勿令太過”的限度如何體現？這些問題依然亟待解決。

基于此，本研究根據前期研究基礎，選取在地榆中含量較高且炒炭過程中變化較大的沒食子酸與鞣花酸作為指標性成分，以抑菌功效為導向，優化地榆炒炭工藝，包括炒炭時間與溫度，初步探尋地榆炒炭程度的Q-Marker，并對炒炭過程中的“存性”問題從藥效和灰化2個上下限度提出思考。

1 儀器與材料

PTHW型調溫電熱套，南通市通州申通電熱器廠；Waters 2695型高效液相色譜儀，沃特世科技（上海）有限公司；Hadera ODS-2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司；TGL-16G型高速離心機，上海安亭科學儀器廠；MS105DU型梅特勒-托利多電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；SB25-12DTD型超聲波清洗機，南京以馬內利儀器設備有限公司；SHZ-D（III）型循環水式真空泵，南京文爾儀器設備有限公司；RE-1000A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；MSDC-5型自動炒貨機，常州市金壇邁斯機械有限公司；Ultrospec 10細胞密度儀，美國哈佛儀器公司；BSC-1604 IIA2型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；B6120型培養箱，賽默飛世爾科技公司；Epoch2 TC型酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽，上海精宏實驗設備有限公司。

地榆飲片（批號20160240）購自于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，為薔薇科地榆屬植物地榆L.的干燥根，由南京中醫藥大學藥學院陸兔林教授鑒定，符合《中國藥典》2020年版一部要求。金黃色葡萄球菌亞種BNCC337371購自北京北納創聯生物技術研究院。

哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（批號C11334141）購自上海麥克林生化科技有限公司；對照品鞣花酸，質量分數96%，批號817C024，購自四川省維克奇生物科技有限公司；對照品沒食子酸，質量分數99%，批號C13O9C72105，購自上海源葉生物科技有限公司；11 cm中速定性濾紙，貨號92410432S，購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲酸為色譜純，購自德國默克公司。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定地榆、地榆炭中沒食子酸、鞣花酸含量

2.1.1 地榆、地榆炭供試品溶液的制備 精密稱取地榆、地榆炭提取物（提取物制備方法見“2.2.2”項）3.75 mg，溶于3.75 mL甲醇中，12 000 r/min（離心半徑5.94 cm）離心10 min后，觀察有無沉淀，若有沉淀，繼續加甲醇稀釋至離心無沉淀，記錄甲醇用量，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品2.17 mg、鞣花酸對照品2.03 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲溶解，制備成含沒食子酸217 μg/mL、鞣花酸203 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Hedera C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（20∶80）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長：沒食子酸為272 nm，鞣花酸為254 nm；進樣量10 μL；圖譜采集時間16 min，所得高效液相色譜圖（圖1）中沒食子酸和鞣花酸的理論塔板數分別為40 900和16 300。

2.1.4 系統適用性考察 將“2.1.1”項下制備所得地榆、地榆炭供試品溶液按“2.1.3”項下色譜條件進行HPLC分析，HPLC圖見圖1，結果可見地榆、地榆炭提取物中共存組分對沒食子酸峰、鞣花酸峰無干擾，分離度良好，說明方法專屬性良好。

2.1.5 線性關系考察 取“2.1.2”項下制備所得沒食子酸、鞣花酸對照品溶液混合制成100 μg/mL的對照品混合溶液作為母液，然后將母液用甲醇稀釋得到100、75、50、25、10、5、1 μg/mL的對照品混合溶液，按“2.1.3”項下條件進行高效液相色譜分析，通過峰面積-濃度做標準曲線，峰面積為縱坐標（），質量濃度為橫坐標（），得到標準曲線分別為沒食子＝2893＋2018，＝0.998；鞣花酸＝9857＋614.2，＝0.996，線性范圍均為1～100 μg/mL，二者在標準曲線質量濃度范圍內線性關系良好。

2.1.6 精密度考察 取地榆炭供試品溶液，連續測定6次，記錄其峰面積并計算其RSD值，結果沒食子酸RSD為1.35%，鞣花酸RSD為1.96%，表明儀器精密度較好。

2.1.7 穩定性考察 取地榆炭供試品溶液，在24 h內每隔4 h測定1次，共測定6次，記錄其峰面積并計算其RSD值，結果沒食子酸RSD為1.54%，鞣花酸RSD為0.59%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.8 重復性考察 連續制備6份相同質量濃度的地榆炭供試品溶液，記錄峰面積并計算沒食子酸和鞣花酸的質量濃度，結果沒食子酸質量濃度為（21.97±0.84）μg/mL，RSD為3.84%，鞣花酸質量濃度為（64.26±2.10）μg/mL，RSD為3.27%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率考察 精密稱取已測定沒食子酸和鞣花酸含量的地榆炭樣品6份，每份5 g，分別加入沒食子酸和鞣花酸對照品溶液適量（與樣品中沒食子酸和鞣花酸等量，分別為1 μg/mg與2.8 μg/mg），按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，測定峰面積并計算質量濃度，計算平均加樣回收率及其RSD，結果沒食子酸和鞣花酸的平均加樣回收率為104.90%、96.04%，RSD分別為0.92%、0.82%。根據《中國藥典》2020年版通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則要求，沒食子酸、鞣花酸的加樣回收率結果均在藥典要求范圍內。

圖1 沒食子酸和鞣花酸對照品(A)、地榆提取物(B)、地榆炭提取物(C)的HPLC圖

2.2 地榆炒炭工藝的考察及提取物的制備

2.2.1 地榆炒炭工藝的考察 稱取約100 g地榆，自動炒貨機設置炒炭溫度并預熱至所需溫度，加入飲片，設置炒炭時間，開始制炭，炒炭結束后即得地榆炭。

2.2.2 地榆、地榆炭提取物制備 稱取地榆或地榆炭100 g，放入粉碎機中粉碎成粉，過《中國藥典》二號篩，篩下的粉末即為粗粉。稱取粗粉約5.0 g置于50 mL的具塞錐形瓶中，加入10倍量的75%乙醇，在50 ℃條件下水浴12 h，取出后50 ℃超聲1 h，用2層濾紙抽濾，取濾液，用旋轉蒸發儀在50 ℃條件下蒸干溶劑后，放入烘箱中烘干，取出茄形瓶并刮出內壁上的物質，得地榆、地榆炭提取物，并按公式計算提取物得率。

提取物得率＝提取物質量/粗粉質量

提取物用甲醇溶解并稀釋至線性范圍，按“2.1.3”項下色譜條件進行HPLC分析，計算地榆及其炮制品提取物中指標成分沒食子酸和鞣花酸的含量，并按公式計算各成分在飲片中的含量。

成分在飲片中含量＝成分在提取物中含量×提取物得率

2.2.3 總鞣質含量測定 參照《中國藥典》2020年版通則2202項下“鞣質含量測定法”測定總鞣質含量。

2.3 炒炭溫度對地榆不同炮制品性狀及指標性成分的影響

2.3.1 炒炭溫度對地榆不同炮制品性狀的影響 炭藥的品質普遍受其炒制程度影響，炒炭溫度與炒炭時間為關鍵參數。將地榆按“2.2.1”項下方法炒制，為單因素考察，炒炭時間統一設置8 min，考察不同炒炭溫度（210～310 ℃）對飲片性狀和指標性成分沒食子酸、鞣花酸含量的影響。

外觀性狀結果（圖2和表1）可知，隨著炒炭溫度的升高，地榆炭表面顏色與內部顏色均逐漸加深，到270、290 ℃時接近《中國藥典》2020年版中所述的“表面焦黑色、內部焦褐色”，而290 ℃時飲片質地顯脆，干燥易折斷；至310 ℃時出現明顯的炭化現象，質地疏松且脆，干燥易折斷。飲片粉末顏色同樣呈現逐漸加深的現象，250～270 ℃時由焦黃色向焦褐色的突變，310 ℃時呈黑褐色。

同時對比飲片提取物得率（表2），地榆不同炮制品提取物的得率隨炒炭溫度的增加而降低，290 ℃后低于生地榆，310 ℃時僅（5.29±0.77）%，這與飲片過度炭化有關，即炭化導致飲片質量的損失。由此可見，炒炭溫度從290 ℃開始質地顯脆，飲片質量出現損失。

2.3.2 炒炭溫度對地榆不同炮制品指標性成分的影響 表2中結果表明，隨著炒炭溫度的升高，提取物中沒食子酸含量先升后降，250 ℃時達峰值，310 ℃時低于生地榆中含量；而鞣花酸含量一直上升，290 ℃時開始顯著上升。同時，隨著炒炭溫度的增加，沒食子酸和鞣花酸在飲片中含量均先增后減，其中沒食子酸也在250 ℃時達峰值，鞣花酸在290 ℃時達峰值，之后迅速下降（表2）。

綜上，當設置炒炭時間8 min，炒炭溫度在250～270 ℃時，地榆炭提取物與飲片中沒食子酸和鞣花酸含量均較高，提取物得率較高，其中270 ℃時的性狀更符合《中國藥典》2020年版描述。

2.4 炒炭時間對地榆不同炮制品指標性成分的影響

根據“2.3”實驗結果，選取沒食子酸和鞣花酸含量均較高，提取物得率也較高的250 ℃作為炒炭溫度，將地榆按“2.2.1”項下方法炒制，考察不同炒炭時間（0～14 min）對指標性成分沒食子酸、鞣花酸含量的影響。表3中實驗結果表明，炒炭時間的影響與炒炭溫度相類似，提取物得率在4～8 min穩定在30%左右，10 min開始顯著下降；與表2相似，提取物中沒食子酸含量先增后減，6 min達峰值[（46.41±0.06）mg/g]，鞣花酸含量則一直增加，最高達[（95.11±0.17）mg/g]；與表2相似，飲片中沒食子酸與鞣花酸含量均先增后減，分別在6 min [（14.20±0.02）mg/g]、10 min[（12.73±0.11）mg/g]處達峰值，之后快速下降。以上研究結果表明，溫度與時間2個炮制參數在控制地榆炮制程度時無明顯差異性。

圖2 地榆生品及不同炒炭溫度下炮制品的性狀圖 (A) 與粉末圖 (B)

表1 地榆生品及不同炮制品外觀與性狀總結

Table 1 Summary of appearance and characteristics of SR and different CSR

樣品表面顏色內部顏色質地粉末顏色 生地榆淺棕色棕白色質地堅硬，不易折斷土黃色 210 ℃ 8 min炮制品焦黃色焦淺黃色質地堅硬，不易折斷土黃色 230 ℃ 8 min炮制品焦深黃色焦黃色質地堅硬，干燥不易折斷焦黃色 250 ℃ 8 min炮制品焦褐色焦淺褐色質地較堅硬，干燥不易折斷焦黃色 270 ℃ 8 min炮制品焦深褐色焦褐色質地較堅硬，干燥不易折斷焦褐色 290 ℃ 8 min炮制品焦黑色焦褐色質地顯脆，干燥易折斷焦褐色 310 ℃ 8 min 炮制品黑色黑色質地疏松且脆，干燥易折斷黑色

表2 地榆生品及不同炒炭溫度下炮制品中沒食子酸、鞣花酸含量變化及提取物得率變化(, n = 3)

Table 2 Changes of gallic acid, ellagic acid contents and extraction yield of SR and CSR at different carbon stir-fryingtemperatures (, n = 3)

樣品沒食子酸/(mg?g?1)鞣花酸/(mg?g?1)提取物得率/% 提取物中飲片中提取物中飲片中 生地榆23.96±0.076.91±0.024.68±0.101.35±0.0328.83±1.33 210 ℃ 8 min炮制品29.80±0.1310.25±0.046.25±0.042.15±0.0134.40±1.61 230 ℃ 8 min炮制品36.03±1.5411.85±0.518.72±0.042.87±0.0132.90±1.88 250 ℃ 8 min炮制品47.50±0.0413.83±0.0127.08±0.097.88±0.0329.11±0.73 270 ℃ 8 min炮制品39.18±1.1011.48±0.3230.16±0.188.68±0.0528.78±0.66 290 ℃ 8 min炮制品42.89±0.059.55±0.0145.27±0.3110.08±0.0722.27±1.15 310 ℃ 8 min炮制品16.19±0.050.85±0.0079.23±0.944.19±0.055.29±0.77

表3 地榆生品及不同炒炭時間下炮制品中沒食子酸、鞣花酸含量變化及提取物得率變化(, n = 3)

Table 3 Changes of gallic acid, ellagic acid contents and extraction yield of SR and CSR at different carbon stir-fryingtime (, n = 3)

樣品沒食子酸/(mg?g?1)鞣花酸/(mg?g?1)提取物得率/% 提取物中飲片中提取物中飲片中 生地榆23.96±0.076.91±0.024.68±0.101.35±0.0328.83±1.33 4 min炮制品31.23±0.0810.09±0.026.81±0.132.20±0.0432.30±1.74 6 min炮制品46.41±0.0614.20±0.0217.76±0.065.43±0.0230.59±0.56 8 min炮制品41.23±0.2611.99±0.0825.24±0.057.34±0.0129.09±1.46 10 min炮制品36.77±0.175.08±0.0292.05±0.8112.73±0.1113.83±0.88 12 min炮制品37.53±0.155.40±0.0285.39±0.2112.30±0.0314.40±1.01 14 min炮制品19.49±0.071.18±0.0095.11±0.175.76±0.016.06±0.61

2.5 相關性考察

實驗數據錄入Excel 2016軟件進行分析，應用Correl、Pearson相關系數評判2個變量之間的線性關系，系數的變化范圍為?1～1。值為0意味著2個變量之間沒有線性關系，絕對值越接近1代表2個變量之間線性關系越強。

炒炭溫度（表2）與炒炭時間（表3）的考察結果觀察到一個共性現象，地榆炭提取物得率開始顯著下降的點（表2中8 min，290 ℃或表3中10 min，250 ℃），正是提取物中鞣花酸含量拐點式上升的點，進而用“2.5”項下CORREL工作表函數計算提取物得率與提取物中成分含量（表2與表3）的相關性，結果見表4，可知，提取物得率與鞣花酸含量相關性極強，兩者且呈反向關系，提取物得率下降點即為鞣花酸含量迅速上升的拐點，此為地榆過度炭化的臨界點，飲片質地開始脆化、灰化。

2.6 體外抗菌活性測定方法建立

2.6.1 菌懸液的配制 金黃色葡萄球菌選取生長良好的菌落于1 mL生理鹽水中，制成菌懸液濃度調至0.5個麥氏比濁標準。麥氏比濁法是一種用比濁來校對菌液濃度的方法，根據美國臨床和實驗室標準協會（clinical and laboratory standards institute，CLSI），0.5個麥氏比濁標準相當于1.5×108個菌/mL。

表4 提取物成分含量與提取物得率的相關系數

Table 4 Correlation coefficient between gallic acid and ellagic acid contents and yield of extract of SR/CSR

地榆及其炮制品與提取物得率的相關系數 沒食子酸含量鞣花酸含量 8 min炒炭時間，不同炒炭溫度下炮制品0.524 167?0.945 55 250 ℃炒炭溫度，不同炒炭時間下炮制品0.406 262?0.964 03

2.6.2 供試藥液的制備 組別設置為測試組、空白組和陽性組。測試組為地榆、地榆炭提取物，先溶解于二甲亞砜（DMSO），再配制成51.2 mg/mL母液，DMSO終濃度0.05%；空白組為生理鹽水；陽性藥為哌拉西林鈉他唑巴坦鈉，先溶解于DMSO，再配制成6.4 mg/mL母液，DMSO終濃度0.05%，備用。

2.6.3 最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定 采用微量液基稀釋法測定抑菌活性，將供試藥液在96孔板中梯度稀釋，得地榆、地榆炭工作液51.2、25.6、12.8、6.4 mg/mL，陽性藥工作液6.4、3.2、1.6、0.8 mg/mL；每孔加入2 μL工作液和198 μL菌懸液，置于37 ℃，80%濕度條件下，靜置培養1 d后，以肉眼未見培養液渾濁的對應濃度定為MIC數值（80%生長受到抑制）。

2.6.4 抑菌圈試驗 設置地榆、地榆炭提取物組（20 mg/mL，先溶于DMSO，再配制成DMSO終濃度為0.05%的藥液）、陽性對照組（5 mg/mL）、生理鹽水組和溶劑對照組。無菌條件下，取瓊脂培養基加菌懸液300 μL，涂布均勻，吸出多余菌液，放置片刻，夾取直徑6 mm的圓形紙片（預先經高壓滅菌），展平，置于培養皿中（每皿4片），輕輕按壓，吸取藥液10 μL滴加于紙片中央，蓋上培養皿，做好標記，37 ℃培養，24 h后觀察并記錄抑菌圈形態、顏色、澄明度與直徑大小，每組3個平行樣。

2.7 微量液基稀釋法考察不同炮制程度對地榆炭抑菌效果的影響

將“2.4”項下所得炒炭溫度統一設置250 ℃時不同炒炭時間（0～14 min）的地榆炮制品，作為不同炮制程度的地榆炭樣品，采用“2.6”項下考察其體外抗菌活性，并建立抗菌活性與指標性成分的相關性。表5中結果所示，地榆6、8 min炮制品對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，優于生地榆，而炭化過度的10、14 min炮制品則不達；這個結果與“2.4”項下實驗結果相對應，即炮制程度適中能夠增加效應物質含量，也能增強藥效，炮制過度則不達。現有研究中多篇文獻報道了地榆止血作用隨著炮制程度的增加呈現先增強后下降的趨勢，炮制時間過長止血作用便不再明顯[5,34]，這種現象或許與地榆的過度炭化相關。

表5 地榆及不同炮制程度地榆炮制品(250℃)對金黃色葡萄球菌的MIC (n = 3)

Table 5 MIC of SR and CSR with different processing degree (n = 3)

樣品MIC/(μg?mL?1) 生地榆128128128 250 ℃6 min炮制品646464 250 ℃8 min炮制品6464128 250 ℃10 min炮制品128128128 250 ℃14 min炮制品128128128 陽性藥222

將表5中地榆及其不同程度炮制品抑菌MIC值與表3中地榆炭提取物指標性成分含量做Pearson相關性分析，結果表明，沒食子酸、鞣花酸含量與MIC值的Pearson相關系數分別為?0.817 1、0.538 2，表明地榆炭對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與沒食子酸的含量相關性較大，且呈正相關性（因MIC值越大表明抑菌效果越弱，Pearson相關系數為負數卻表明兩者之間的正相關性），即炮制過程中觀測沒食子酸含量能夠一定程度上反應地榆炭的抑菌功效。同時，近期基于灰色關聯分析研究地榆炒炭止血的物質基礎，結果表明沒食子酸是地榆炭中發揮凝血止血活性的重要成分[35]，所以提出可以將沒食子酸含量視為地榆炒炭Q-Marker的研究思路。

綜上，地榆采用自動炒貨機在250 ℃溫度條件下炒炭6 min能獲得具最優抑菌效果的地榆炭，且此時地榆炭提取物得率達30%左右，指標性成分沒食子酸在提取物［（46.41±0.06）mg/g］和飲片中［（14.20±0.02）mg/g］，含量均達峰值。

2.8 抑菌圈實驗驗證最優炮制工藝下地榆炭的抑菌效果

根據“2.7”項下優化所得最優炮制工藝制備地榆炭，參照《中國藥典》2020年版通則2202項下鞣質含量測定法測定總鞣質含量，地榆、地榆炭中總鞣質含量分別為（18.65±0.06）%、（9.86±0.08）%，均符合藥典標準。

因中藥抑菌效應遠弱于抗生素，不能形成輪廓清晰、圓整澄清的抑菌圈，也受中藥藥液顏色的影響，所以僅用抑菌圈直徑的大小來評價中藥抑菌效應不太客觀。圖3所示實驗結果表明，同質量濃度下，地榆炭組能形成邊界較清晰的抑菌內圈，其直徑為（1.33±0.12）cm（以細菌幾無生長、澄明度顯澄清的內圈直徑計），以及抑菌外圈（無明顯邊界，渾濁），而地榆組因在培養皿表面抑菌深度淺，只有抑菌外圈，未觀察到邊界清晰、幾無細菌生長的抑菌內圈，表明抑菌圈實驗與微量液基稀釋法（表5）實驗結果相似，地榆、地榆炭均顯示一定抑菌效果，且最優炮制工藝下的地榆炭優于生地榆，表明炮制工藝對中藥效應的重要影響。

1-地榆提取物 2-地榆炭提取物 3-生理鹽水 4-溶劑 5-陽性藥

4 討論

“凡藥制造，不及則功效難求，太過則氣味反失”（《本草蒙筌》）道出了炮制的上下限度要求。本研究從藥效與灰化2個角度闡釋了“炒炭存性”的科學內涵，通過實驗結果對前言提出的問題進行解答：地榆炭存地榆之性，也具顯著抗菌效果，且在優化的炮制工藝下抗菌功效顯著強于生地榆；篩選得最優炒炭工藝條件為250 ℃溫度條件下炒炭6 min；此時地榆炭提取物得率達30%左右，沒食子酸含量達峰值，具顯著優于生地榆的抑菌效果；提出可以將沒食子酸含量視為地榆炒炭Q-Marker的研究思路；提出地榆炭提取物得率的突然下降可視為飲片過度炭化的關鍵節點，即灰化臨界點的研究思路。

課題組前期對地榆炒炭前后的成分進行了定性和定量的研究，表明地榆炒炭過程中發生了大量大分子裂解成小分子的事件，其中沒食子酸和鞣花酸分別為沒食子酸鞣質與鞣花酸鞣質高溫裂解的終端產物，其中沒食子酸能夠進一步轉化為其下游產物焦性沒食子酸（另撰文發表）。本實驗結果印證了上述結果，即隨著地榆高溫炮制，沒食子酸含量先增加后減少，鞣花酸含量則一直上升[5]。炭藥的品質與其炒炭工藝息息相關，研究結果解釋了經常出現同一種炭藥的臨床療效或研究結果有差異甚至截然不同的現象，由此凸顯根據藥效優化和規范炒炭工藝的重要性。

有研究結果表明，市售地榆炭色澤普遍較深，外表為棕黑或黑色，內部多為棕黑色或黑褐色，粉末多為棕黑或黑褐色，醇浸出物得率顯著低于生品，83%市售地榆炭中鞣質含量未達生品中1/3[36]，由于地榆炭中鞣質含量隨炮制程度增加而下降[5]，以上現象均預示市售地榆炭可能普遍存在過度炭化現象。同時，課題組前期也對不同出處地榆炭進行品質考察，飲片色澤普遍較深，沒食子酸2.15～12.28 mg/g，鞣花酸5.33～12.76 mg/g，多為沒食子酸含量低于鞣花酸，同樣揭示了市售地榆炭普遍存在過度炭化現象。從沒食子酸含量來看市售地榆炭品質遠低于本研究中優化炮制工藝所得地榆炭（14.20±0.02）mg/g；然而，優化工藝所得地榆炭表面焦褐色，內部焦淺褐色，與藥典所述“表面焦黑色、內部焦褐色”不甚相符；而當將地榆炮制至藥典所述外觀性狀時（8 min，290 ℃或10 min，250 ℃），其已開始越過灰化臨界點。有趣的是，藥典對沒食子酸含量的規定，地榆炭（不少于0.60%）比地榆（不少于1.0%）中低，與其對飲片色澤描述（“表面焦黑色、內部焦褐色”）相一致。

地榆炭的研究尚處起步階段，只有建立和完善質量標準，規范炮制工藝，量化檢測手段，才能保證飲片質量的穩定性，有利于進一步臨床應用與基礎研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of processing technology on antibacterial effect ofbased on theory of “maintaining medicinal properties after carbonisatus”

GU Wei1, 2, 3, YAO Jun-hong1, 4, LU Meng-meng2, SU Man5, ZOU Jun-qing2, CAI Xu-yi2, ZHAO Hong-yu6, SONG jin-yun6, GE Chang7,LI Jian2, TONG Huang-jin8, CHEN jun1, 2

1. Jiangsu Provincial Engineering Research Center of TCM External Medication Development and Application, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing, Nanjing 210023, China 4. Laboratory Animal Center, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 5. Lianyungang Food and Drug Inspection and Testing Center, Lianyungang, Lianyungang 222000, China 6. Department of Clinical Research Center, The Second Hospital of Nanjing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210009, China 7. The First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 8. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

The theory of “Maintaining medicinal properties after carbonisatus (MMPC)” was explained from the perspectives of pharmacodynamics and ashing. Meanwhile, the processing method of carbonizing by stir-frying of(SR) was optimized and the quality markers (Q-Marker) in processing as well as the parameters characterizing ashing critical point were discussed.The effects of temperature and time of carbonizing by stir-frying on the appearance, yield, the index composition and inhibition onof Charred(CSR) were investigated to optimize processing technology.The results showed that with the aggravation of processing degree, the content of gallic acid in CSR extract increased first and then decreased, while ellagic acid kept increasing. Antibacterial effect of CSR was confirmed to increase by processing, explaining the MMPC principle. Meanwhile, there was a strong and positive correlation between the bacteriostatic effects and the content of gallic acid in CSR extract. The yield of CSR extract and the ellagic acid content in extract showed a strong reverse correlation (correlation coefficient = ?0.964 03). It was observed that when the yield of CSR extract suddenly declined, the texture of medicinal materials begun embrittling and ashing. Moreover, the best processing condition of CSR was obtained: SR was carbonized by stir-frying at the temperature of 250 ℃ for 6 min. This moment, the extract yield was about 30% and the content of gallic acid reached the peak in both the extract [(46.41 ± 0.06) μg/mg] and medicinal materials [(14.20 ± 0.02) μg/mg]. The bacteriostatic effects of CSR were better than those of the raw SR.In this study, the authors put forward the research idea of using gallic acid content in extract to guide the carbonizing by stir-frying technology of SR and controlling the critical point of ashing by the yield of extract, and optimize the processing technology of SR based on bacteriostatic effect.

; processing; maintaining medicinal properties after carbonisatus; bacteriostatic effects; quality markers; gallic acid; ellagic acid; pharmacodynamics; ashing

R283.1

A

0253 - 2670(2022)04 - 1042 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.010

2021-09-02

江蘇省中醫藥科技發展計劃青年基金項目（QN202005）；江蘇省藥學會—靳培英基金項目（J2021002）

顧 薇（1981—），副教授，博士，主要從事中藥炮制與制劑研究。Tel: 13584095898 E-mail: 6464966@qq.com

童黃錦（1983—），副主任藥師，博士，主要從事中藥質量控制及炮制機制研究。Tel: 13770330158 E-mail: hjtong62@126.com

陳 軍（1975—），教授，博士，主要從事中藥外用制劑研究。Tel: (025)85811611 E-mail: chenjun75@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]