沉香提取物對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用及機制研究

馬家樂，符昭君，王鑫玉，靳鳳玉，趙一慕，孟英心，王凌瀟，李 軍，鄭 姣

沉香提取物對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用及機制研究

馬家樂，符昭君，王鑫玉，靳鳳玉，趙一慕，孟英心，王凌瀟，李 軍*，鄭 姣*

北京中醫藥大學中藥學院 中藥現代研究中心，北京 100029

利用皮質酮誘導大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株PC12損傷，模擬糖皮質激素誘發神經功能障礙的病理過程，探討沉香提取物對神經細胞的保護作用及其機制。采用400 μmol/L皮質酮誘導的PC12細胞作為神經元損傷模型，給予沉香提取物（5、10、20 μg/mL）干預細胞24 h后，利用CCK-8試劑盒檢測細胞存活率；采用Hoechst 33258染色和流式細胞術檢測細胞凋亡率；通過Western blotting檢測凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、cleaved Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]、cleaved PARP表達情況。與對照組比較，皮質酮處理PC12細胞24 h后細胞存活率顯著降低（＜0.01），細胞凋亡率顯著升高（＜0.01），cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，給予沉香提取物24 h后細胞存活率顯著升高（＜0.05、0.01），凋亡率顯著降低（＜0.01），cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）。沉香提取物通過調控Caspase-3/PARP通路改善皮質酮誘導的PC12細胞凋亡，從而保護神經元。

沉香；PC12細胞；神經損傷；皮質酮；凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是一種常見的致殘性精神障礙疾病，影響著全世界約3.5億人[1-2]。當抑郁癥發生時，機體感受到應激源激活下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary- adrenal，HPA）軸，從而導致腎上腺皮質合成糖皮質激素（glucocorticoids，GCs）。GCs在機體代謝、免疫功能等多種生命活動過程的調節中起著至關重要的作用。GCs的分泌和血液中GCs的水平可通過HPA軸的負反饋抑制來調節[3]。由于極端或慢性壓力，持續暴露于血液中高濃度的GCs會導致HPA軸和負反饋機制的功能障礙，導致GCs過度分泌，從而對神經系統造成損害[4]。中樞神經系統慢性應激誘導的神經元細胞死亡是神經功能障礙的原因之一，包括記憶喪失、學習障礙和認知障礙，還可能引發焦慮和抑郁等精神障礙[5]。嚙齒動物體內的GCs主要是皮質酮，由于HPA反饋功能障礙，持續暴露于高濃度皮質酮可引起病理性海馬神經元損傷，誘發抑郁樣行為[6]。因此，改善皮質酮誘導的神經元損傷已成為治療焦慮和抑郁的潛在靶標。

沉香為瑞香科沉香屬植物白木香(Lour.) Gilg含樹脂的木材，是沉香四味散、八味沉香散、沉香化氣丸等經典名方的主要組成藥味。沉香作為名貴中藥材已有千年應用歷史，被列為“沉檀龍麝”四香之首，具有非常寶貴的藥用價值。沉香作為藥物始載于梁代陶弘景的《名醫別錄》，名列上品，曰：“沉香、薰陸香、雞舌香、藿香、詹糖香、楓香并微溫。悉治風水毒腫，去惡氣”。在《本草綱目》中，李時珍就用“去惡氣，清人神”來描述沉香的功效?，F代藥理學研究表明，沉香具有鎮靜催眠、抗焦慮、抗抑郁的作用，但僅為活性篩選和藥效評價，尚未深入闡明沉香鎮靜安神的作用機制[7-10]。大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株PC12是一種具有典型神經元特征并具有高水平GCs受體的細胞系，已被用作模擬高濃度皮質酮刺激時海馬神經元損傷的經典模型。因此本研究利用皮質酮誘導的PC12細胞模型，初步探究沉香提取物的神經保護作用和機制，為沉香防治抑郁癥提供研究基礎和依據。

1 材料

1.1 細胞

PC12細胞由北京大學曾克武教授贈予。

1.2 藥材

沉香購自海南，經北京大學屠鵬飛教授鑒定為瑞香科植物白木香(Lour.) Gilg含樹脂的木材。

1.3 試劑

DMEM培養基（批號11965092）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號15140163）、胎牛血清（批號12483020）、PBS溶液（批號20012050）、胰酶（批號25200072）均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號BN15201）購自北京拜爾迪生物技術有限公司；皮質酮（批號S30265）購自上海源葉生物科技有限公司；Hoechst 33258（批號23491-45-4）購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）雙染細胞凋亡試劑盒（批號556547）購自美國BD公司；RIPA裂解液（批號P0013B）購自上海碧云天生物技術有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號14220S）、聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]抗體（批號9532T）、β-actin抗體（批號3700T）、HRP標記的山羊抗兔抗體（批號7074P2）均購自美國CST公司。

1.4 儀器

多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）；冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；CriterionTM型電泳槽（美國Bio-Rad公司）；DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠）；細胞培養箱（日本Sanyo公司）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；分析型高效液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）。

2 方法

2.1 沉香提取物的制備

取沉香藥材粉末10 kg，分別用10、8、8倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h，共得到3 kg浸膏，即為沉香提取物（由北京中醫藥大學現代研究中心化學實驗室提供）。經HPLC檢測沉香提取物中沉香四醇質量分數為1.89%。

2.2 PC12細胞培養

PC12細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM完全培養基，于5% CO2、37 ℃的恒溫培養箱中培養。待2～3 d細胞融合度達到80%時，用0.125%的胰酶消化，進行傳代處理。

2.3 皮質酮對PC12細胞存活率的影響

取對數生長期的PC12細胞，以4×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h。設置空白組、對照組和實驗組?？瞻捉M不加入細胞，加入完全培養基后不做任何處理；對照組用完全培養基正常培養PC12細胞；實驗組分別加入100 μL終濃度為200、400、600、800、1000 μmol/L的皮質酮處理細胞。培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育1 h，采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

2.4 沉香提取物對PC12細胞存活率的影響

取對數生長期的PC12細胞，以4×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h。設置空白組、對照組和實驗組。空白組不加入細胞，加入完全培養基后不做任何處理；對照組用完全培養基正常培養PC12細胞；實驗組分別加入100 μL終質量濃度為10、50、100、200 μg/mL的沉香提取物處理細胞。培養24 h后，采用CCK-8法檢測細胞存活率。

2.5 沉香提取物對皮質酮誘導的PC12細胞損傷模型細胞存活率的影響

取對數生長期的PC12細胞，以4×104/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h。設置空白組、對照組、模型和給藥組?？瞻捉M不加入細胞，加入完全培養基后不做任何處理；對照組用完全培養基正常培養PC12細胞；模型組和給藥組加入終濃度為400 μmol/L的皮質酮；給藥組再分別加入終質量濃度為5、10、20 μg/mL的沉香提取物處理細胞。培養24 h后，采用CCK-8法檢測細胞存活率。

2.6 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡情況

取對數生長期的PC12細胞，以8×104/mL接種于6孔板中，培養過夜。按“2.5”項下方法分組及給藥，吸去培養液，加入0.5 mL 4%多聚甲醛組織固定液，固定20 min；PBS溶液洗滌2次，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，37 ℃避光染色20 min；PBS溶液洗滌2次，于熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態并拍照。

2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率

按“2.6”項下方法分組及給藥，用0.125%胰酶消化成單細胞懸液，收集細胞；PBS溶液洗滌2次，1000 r/min離心5 min，收集細胞；加入190 μL 1×Binding Buffer混懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，避光室溫放置10 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.8 Western blotting檢測細胞凋亡相關蛋白表達

按“2.6”項下方法分組及給藥，PBS溶液洗滌2次，于冰上用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白，99 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入Caspase-3、PARP、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗兔抗體，4 ℃孵育4 h；TBST洗滌3次后顯影成像，用Image J軟件進行灰度分析。

2.9 統計學分析

實驗數據采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計學分析，計量資料用表示，兩組之間比較采用檢驗。

3 結果

3.1 皮質酮對PC12細胞存活率的影響

如圖1所示，皮質酮（200、400、600、800、1000 μmol/L）刺激PC12細胞24 h后，細胞存活率均顯著降低（＜0.01），表明皮質酮能抑制PC12細胞生長，且呈劑量相關性。400 μmol/L皮質酮刺激PC12細胞24 h后，細胞存活率為50%，因此選擇400 μmol/L皮質酮刺激PC12細胞24 h作為神經元細胞損傷模型的實驗條件。

與對照組比較：##P＜0.01，圖2同

3.2 沉香提取物對PC12細胞存活率的影響

如圖2所示，與對照組相比，沉香提取物（10、50、100 μg/mL）對PC12細胞存活率無顯著影響，沉香提取物（200 μg/mL）組PC12細胞存活率顯著降低（＜0.01）。因此后續沉香提取物給藥質量濃度控制100 μg/mL以內。

3.3 沉香提取物對皮質酮誘導的PC12細胞損傷模型細胞存活率的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組PC12細胞存活率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，沉香提取物組細胞存活率均顯著升高（＜0.05、0.01），且呈劑量相關性。提示沉香提取物對皮質酮誘導的神經元損傷有良好的保護作用。

圖2 沉香提取物對PC12細胞存活率的影響(, n = 3)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.4 沉香提取物對皮質酮誘導的PC12細胞損傷模型細胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色劑是一種核酸染料，能將凋亡細胞的細胞核標記為亮藍色熒光。Hoechst染色結果見圖4，其中箭頭所指向為凋亡細胞，與對照組對比，模型組發出亮藍色熒光的細胞數量明顯增多，表明皮質酮能夠導致PC12細胞損傷并誘發細胞凋亡；沉香提取物組發出亮藍色熒光的細胞數目明顯減少，且呈劑量相關性，表明沉香提取物能夠抑制皮質酮誘導的PC12細胞凋亡。

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術是一種極為靈敏的細胞凋亡檢測手段。采用Annexin V-FITC/PI雙染法對PC12細胞進行染色后，利用流式細胞儀對處于不同階段的細胞進行分選。結果如圖5所示，與對照組相比，模型組Q2象限晚期凋亡和Q4象限早期凋亡細胞均明顯增加，細胞凋亡率顯著升高（＜0.01），表明皮質酮誘導PC12細胞凋亡；與模型組比較，沉香提取物組Q2和Q4象限細胞減少，細胞凋亡率降低，呈劑量相關性，其中沉香提取物（20 μg/mL）組具有顯著性差異（＜0.01），表明沉香提取物可通過抑制PC12細胞凋亡發揮保護作用。

箭頭所指為凋亡細胞

3.5 沉香提取物對皮質酮誘導的PC12細胞損傷模型凋亡相關蛋白的影響

當細胞發生凋亡時，Caspase-3發生剪切變成cleaved Caspase-3，同時激活PARP，誘導PARP蛋白發生剪切化，因此檢測Caspase-3和PARP以及相應的剪切態的蛋白表達，進而探究沉香提取物調控PC12細胞凋亡的靶點。如圖6所示，與對照組比較，模型組細胞cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，沉香提取物組細胞cleaved PARP/PARP和cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），表明沉香提取物可以通過調控Caspase-3/PARP抑制PC12細胞凋亡，從而起到細胞保護作用。

4 討論

MDD是一種精神健康障礙，是造成全球疾病負擔的主要因素，其特征為普遍且持續的情緒低落，目前已經成為普遍關注的熱點[11]。然而，由于其發病機制不明、致病因素復雜，臨床上使用的經典抗抑郁藥的療效并不理想[12]。苯二氮類藥物的長期使用或聯合使用藥物可能會導致藥物成癮、嗜睡、運動障礙等嚴重的不良反應[13]。因此，尋找長期使用安全且不會造成嚴重不良反應的天然藥物十分必要。中藥沉香作為傳統的理氣藥，其化學成分和活性已被廣泛報道[14-15]。Wang等[16]通過動物行為學實驗，證明了沉香揮發油具有抗焦慮和抗抑郁作用；王燦紅等[17]通過化合物靶點預測發現沉香有抗焦慮和抗抑郁的“雙重調節”作用。然而，目前還沒有關于沉香對于GCs誘導的神經元損傷的神經保護作用及其潛在機制的研究。

本課題組前期研究表明，持續暴露于高濃度GCs可抑制神經元生長和分化，導致海馬神經細胞DNA損傷，最終導致細胞凋亡[18]。用高濃度的皮質酮誘導PC12細胞已被用作模擬神經元損傷的體外經典實驗模型。本研究通過不同濃度的皮質酮處理PC12細胞建立神經元損傷細胞模型，發現皮質酮顯著降低PC12細胞存活率，并以劑量相關性方式加劇細胞死亡，故選擇400 μmol/L皮質酮刺激PC12細胞24 h作為神經元細胞損傷模型的實驗條件。如果能保護神經元免受皮質酮的損傷，慢性應激引起的神經功能障礙可能會減少。因此從神經元細胞保護的角度，探究沉香提取物的抗抑郁作用。通過CCK-8法檢測PC12細胞存活率，發現給予沉香提取物后，細胞存活率呈劑量相關性升高，提示沉香提取物對皮質酮誘導的神經元損傷有良好的保護作用。通過Hoechst 33258染色法和流式細胞術檢測PC12細胞凋亡情況，結果與文獻報道一致[19]，皮質酮能夠誘導PC12細胞的凋亡，沉香提取物可以劑量相關性地抑制皮質酮誘導的PC12細胞凋亡。

為了探究沉香提取物抑制皮質酮誘導的PC12細胞凋亡的作用機制，考察細胞程序性凋亡途徑相關蛋白Caspase-3/PARP以及對應剪切態蛋白的表達。Caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行者，部分或全部負責許多關鍵蛋白質的蛋白水解裂解。Caspase-3激活后進一步切割PARP并觸發染色體DNA斷裂和片段化，最終導致細胞凋亡[20]。Western blotting結果顯示，皮質酮處理后能激活Caspase-3和PARP的剪切，而沉香提取物以劑量相關性方式降低了cleaved PARP和cleaved Caspase-3的蛋白表達水平。表明皮質酮誘導PC12細胞DNA片段化并觸發細胞凋亡，沉香提取物能有效地抑制細胞凋亡，從而起到細胞保護作用。

綜上，本研究發現沉香提取物能夠通過調控Caspase-3/PARP蛋白，抑制皮質酮誘導的PC12細胞凋亡，從而發揮神經元保護作用，沉香提取物可以作為一種神經保護劑用于受到皮質酮損傷的神經細胞，為沉香治療焦慮與抑郁的臨床應用提供理論依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect and mechanism ofextract on corticosterone induced PC12 cells injury

MA Jia-le, FU Zhao-jun, WANG Xin-yu, JIN Feng-yu, ZHAO Yi-mu, MENG Ying-xin, WANG Ling-xiao, LI Jun, ZHENG Jiao

Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Corticosterone was used to induce the injury of rat adrenal medulla pheochromocytoma cell line PC12 to simulate the pathological process of glucocorticoid-induced neurological dysfunction, so as to explore the protective effect and mechanism of Chenxiang () extract on nerve cells.PC12 cells induced by 400 μmol/L corticosterone were used as neuron injury model. After 24 h of intervention withextract (5, 10, 20 μg/mL), cell survival rate was detected by CCK-8 kit; Hoechst 33258 staining and flow cytometry were used to detect cell apoptosis rate; Western blotting was used to detect apoptosis-related proteins cystein-asparate protease-3 (Caspase-3), cleaved Caspase-3, poly(ADP-ribose)polymerase (PARP) and cleaved PARP expressions.Compared with control group, survival rate of PC12 cells treated with corticosterone for 24 h was significantly decreased (< 0.01), apoptosis rate was significantly increased (< 0.01), cleaved PARP/PARP and cleaved Caspase-3/Caspase-3 protein expressions were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, survival rate of P12 cells treated withextract for 24 h was significantly increased (< 0.05, 0.01), apoptosis rate was significantly decreased (< 0.01), cleaved PARP/PARP and cleaved Caspase-3/Caspase-3 protein expressions were significantly decreased (< 0.01).extract improves corticosterone-induced apoptosis of PC12 cells by regulating PARP/Caspase-3 pathway, thereby protecting neurons.

; PC12 cells; nerve injury; corticosterone; apoptosis; Caspase-3; poly(ADP-ribose)polymerase

R285.5

A

0253 - 2670(2022)04 - 1093 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.016

2021-11-03

國家自然科學基金資助項目（82003912）；國家重點研發項目（2018YFC1706400）

馬家樂（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學。Tel: 17864191175 E-mail: 17864191175@163.com

李 軍，博士生導師，研究員，主要從事中藥藥效物質及作用機制研究。E-mail: drlj666@163.com

鄭 姣，碩士生導師，副研究員，主要從事中藥藥理研究。E-mail: zj98v2@163.com

[責任編輯 李亞楠]