半夏連作對根際土壤微生物群落的影響研究

劉詩蓉，王紅蘭，孫 輝，楊 萍，蔣舜媛，蔣桂華

半夏連作對根際土壤微生物群落的影響研究

劉詩蓉1, 2，王紅蘭2*，孫 輝3，楊 萍2，蔣舜媛2，蔣桂華1*

1. 成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137 2. 四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041 3. 四川大學環境科學與工程系，四川 成都 610065

探明半夏連作對根際土壤微生物群落的影響規律，以指導半夏連續高產栽培。采用 PacBio Sequel測序手段對正茬（CK）、連作一茬（A）、二茬（B）和三茬（C）半夏不同生長時期根際土壤微生物進行測序，對比分析其微生物群落結構和多樣性差異。隨著連茬次數的增加，潛在致病細菌如果膠桿菌、真菌如子囊菌門Ascomycota菌群、鐮刀菌屬真菌和瓜亡革菌等豐度增加，球黑孢霉隨著連茬次數的增加逐漸成為優勢菌群，有益真菌如球囊菌門Glomeromycota菌群豐度減少；隨著連茬次數增加，半夏根際土壤中細菌和真菌多樣性均降低；根際土壤pH值隨著半夏生長周期的延長波動變化，可能導致根際細菌和真菌多樣性和功能類群變化，從而使一些致病菌在半夏塊莖膨大期和成熟期形成優勢種群。隨著半夏連茬次數的增加，根際土壤有益微生物豐度減少、有害微生物豐度增加，根際土壤微生物群落多樣性降低，根際土壤pH值波動變化，是半夏連作障礙形成的重要原因。

半夏；連作障礙；根際土壤；PacBio Sequel測序；微生物多樣性；群落結構

大宗中藥材半夏為天南星科植物半夏(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，始載于《神農本草經》[1]，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結等功效[2]。隨著半夏市場需求增加引發的供需矛盾日益尖銳，人工栽培半夏已經成為必然趨勢。四川盆地是半夏傳統道地產區，課題組前期在盆地丘陵區的田間試驗初步結果顯示半夏同一地塊連作第2～5年產量分別比第1年下降21.5%、36.7%、55.4%、68.6%，產量降低量達到顯著性水平（未發表數據），主要表現為隨著連茬次數增加半夏植株生長不良、珠芽繁育系數降低和病蟲害日益嚴重。

很多農作物和經濟植物種植過程中均存在連茬效應。關于植物栽培連作障礙主要誘因，國內外相關研究學者認為主要有土壤理化性質惡化[3]、土壤微生物群落結構和功能類群的變化[4]以及植物根系分泌物的化感作用[5]等。許多植物連作后土壤pH下降，土壤中礦質養分有效性降低，對土壤微生物功能類群產生重要影響，最終反映至土壤生物活性[6]。亦有研究表明，連茬使土壤微生物群落真菌化趨向日益明顯[7]，如地黃長期連作后根際土壤細菌種類減少、群落結構趨于簡單[8]，有益類群退化、有害類群豐富度增加[9]。事實上，連茬效應很可能是多種機制綜合作用的結果。三七、百合、丹參、半夏、地黃等連茬效應在栽培中非常明顯，這些藥材產業化栽培中每茬不得不換地進行輪作，不利于基地建設和基礎設施改善，因此連作障礙成為制約很多藥材進行產業化栽培的最主要因素之一。

土壤微生物群落結構和功能類群的變化為半夏連作障礙形成的重要原因，有關半夏栽培過程中根際微生物多樣性變化的研究也有部分報道。研究表明，連作使半夏根際土壤細菌和放線菌數量、微生物總數降低，真菌數量增加，即土壤由“細菌型”向“真菌型”轉換，且真菌多樣性顯著低于未耕作土壤[10-13]。然而由于手段受限，對半夏連作后何種細菌或真菌發生何種變化尚不清楚。因此，本研究采用PacBio Sequel微生物3代測序手段，研究不同連作茬數下半夏根際土壤真菌及細菌的動態變化，并對門及種水平的細菌及真菌群落結構進行分析，結合根際土壤pH的動態變化，闡明連作條件對半夏根際土壤的微生物群落結構的影響，以期揭示半夏連作障礙機制，為緩解半夏連作障礙提供理論依據和技術支撐。

1 材料與試驗地

1.1 材料

供試半夏種莖來自于重慶市大足縣，經四川省中醫藥科學院中藥資源與種植研究所周毅研究員鑒定為天南星科植物半夏(Thunb.) Breit.的新鮮根莖。

1.2 試驗地概況

田間試驗設在四川省內江市中區四川天貝生態農業中藥材試驗基地（E104°85′12′′，N29°49′68′′）進行。該基地為亞熱帶濕潤季風氣候，冬暖夏熱，雨量適中，年相對濕度約80%，年均降雨量約920 mm。該區域地形以低山丘陵為主，基地東南、西南面有低山環繞。試驗地土壤為紫紅色砂質泥巖母質發育的中性至石灰性紫色土，為壤質土，其砂粒（0.05～2 mm）、粉粒（0.002～0.05 mm）及黏粒（＜0.002 mm）[14]質量分數分別為21%、51%和28%。試驗開展前，在同一塊地劃分的不同小區連續栽種半夏，形成不同連作茬數的處理樣地，并按生態種植模式進行試驗栽培管理[15]。

2 方法

2.1 樣品處理

試驗設正茬（CK）、連作一茬（A）、二茬（B）和三茬（C）4個處理。試驗小區布置采用隨機區組設計，每一處理設置3個重復，小區面積為3 m×1.2 m＝3.6 m2。種莖通過篩分，選用直徑1.0～1.5 cm半夏塊莖作為試驗用種莖，種莖在播種前用惡霉靈、春雷霉素和霜霉威鹽按一定比例加水稀釋成一定濃度，浸種30 min，晾干，并于播種前將同濃度藥液噴淋于土壤表層深翻進行土壤消毒。半夏于2019年9月3日播種，覆土深度為8 cm。整個試驗過程田間管理措施均保持一致。

2.2 樣品采集

分別于播種后30 d（半夏出苗期）、60 d（半夏塊莖膨大期）和90 d（成熟期）采集各小區半夏植株。按“S”布點法采樣，先去掉0～2 cm表土，輕輕抖掉根系外圍土，再用毛刷輕刷黏附在根表面的土壤作為根際土壤。4個處理（CK、A、B、C）共采集12組樣品，分別標記為CK30、CK60、CK90、A30、A60、A90、B30、B60、B90、C30、C60、C90。每次土壤樣品采集后，立即分為2部分，一份將每個處理3個重復的樣品混合均勻，立即置于液氮罐中帶回實驗室，于?80 ℃保存，用PacBio Sequel進行根際土壤微生物群落測序分析；另一份土樣自然風干，并剔除石礫、根系等雜物，磨細，過2 mm（10目）篩后測定土壤pH值。

2.3 土壤DNA提取與PCR擴增

取0.25 g土壤樣品，按試劑盒（PowerSoil? DNA Isolation kit）操作流程，提取土壤總DNA，細菌16S rRNA V1～V9區全長引物27F(5’-A GRGTTTGATYNTGGCTCAG-3’)/1492R(5’-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3’），真菌ITS rRNA全長引物ITS1（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）通過上述引物分別合成帶有Barcode的特異引物，進行PCR擴增。反應體系：10 μL的KOD FX Neo Buffer（2×），4 μL的dNTP（2 mmol/L），0.4 μL的KOD FX Neo（TOYOBO公司），5 ng的DNA模版，1 μL的正向引物（10 μmol/L)，1 μL的反向引物（10 μmol/L），然后用ddH2O補足10 μL。程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃延伸5 min。

2.4 文庫構建與測序

對上述進行PCR擴增的產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫（SMRT Bell），建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用PacBio Sequel進行測序。

2.5 數據分析

對原始下機subreads進行校正得到CCS（circular consensus sequencing）序列（SMRT Link，version 8.0），使用lima（v1.7.0）軟件，通過barcode序列識別不同樣品的CCS序列并去除嵌合體，得到高質量的CCS序列，使用cutadapt v2.7（錯誤率0.2）識別正向引物與反向引物，丟棄不包含引物的CCS序列，并對CCS長度進行濾過，在相似性97%的水平上對序列進行聚類（USEARCH，version 10.0），以測序所有序列數的0.005%作為閾值濾過OTU。使用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva（細菌）和UNITE（真菌）分類學數據庫對OTU進行分類學注釋。

3 結果與分析

3.1 半夏連作對根際土壤pH值的影響

pH是土壤重要的基本性質，直接影響土壤養分的存在狀態、轉化和有效性。圖1給出了半夏不同連茬次數下土壤pH的變化規律。由圖1可知，半夏根際土壤pH值介于7.13～7.99，不同連作茬數處理下半夏出苗期（30 d）pH較播種前均下降，且半夏塊莖膨大期（60 d）和成熟期（90 d）的pH值較出苗期（30 d）的有所增加，這可能與半夏不同生長時期次生代謝產物有關。同時，隨著半夏連茬次數的增加，土壤pH呈先下降后增加再下降的變化趨勢。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

3.2 半夏連作對根際土壤細菌群落的影響

對12個半夏根際土壤樣品進行測序并通過Barcode識別后共獲得細菌68 922條CCS序列，每個樣品至少產生2836條CCS序列，平均產生5744條CCS序列。采用Mothur方法進行97%相似水平下的OTU分類，并使用Silva數據庫對細菌OTU序列進行相似性比對。共獲得OTU數1865個，分類學地位明確的細菌有21個門、38個綱、85個目、125個科、271個屬、332個種。

3.2.1 根際土壤細菌α多樣性指數分析 α多樣性（alpha diversity）反映的是單個樣品物種豐度（richness）及物種多樣性（diversity）。ACE指數衡量物種豐度即物種數量的多少，ACE指數越大，表示物種豐度越大。Shannon指數則能反映樣品中微生物的多樣性，Shannon指數越大則種類越多，物種越豐富。圖2給出了半夏不同連茬次數下根際土壤細菌ACE指數和Shannon指數的變化規律。由圖2-a可知，半夏出苗期（30 d）和塊莖膨大期（60 d），ACE指數隨著連茬次數的增加呈現出先增加后減少的趨勢；半夏成熟期，ACE指數變化規律為先降低后增加再降低。其中，ACE指數的增加在塊莖膨大期連作二茬時表現尤為明顯，表明連作二茬后，土壤細菌物種豐度增加。結合田間觀察發現，半夏在塊莖膨大期易患根腐病，這可能與該時期有害細菌物種豐度增加有關。如圖2-b所示，Shannon指數隨著半夏連茬次數的增加而減少，表明半夏連作后土壤細菌多樣性降低。即半夏連作可導致土壤細菌物種多樣性降低。

圖2 半夏不同連茬次數下根際土壤細菌群落豐度(a) 和多樣性指數(b)

3.2.2 根際土壤細菌β多樣性分析 細菌OTU聚類結果表明（圖3-a），半夏不同連作茬數，相同的生長周期多聚為一類。且隨著連茬次數的增加，連茬次數越多，與正茬細菌群落的相似性越少。結合主成分分析結果（圖3-b）發現，連作三茬處理的離散度最大。由此表明，半夏不同連作茬數在相同生長周期細菌多樣性相似，而不同生長周期之間細菌多樣性差異大，尤其是連作二茬以后。半夏不同生長周期對其細菌多樣性影響較大，且隨連茬次數的增加，細菌多樣性差異越來越明顯。

圖3 半夏連作下根際土壤細菌UPGMA聚類樹圖(a)和PCA分析圖(b)

3.2.3 根際土壤細菌組成分析 根據物種注釋的結果，不同連茬次數下半夏根際土壤細菌相對豐度最高的10個細菌類相同，分別為變形菌門Proteobacteria、浮霉菌門Planctomycetes、擬桿菌門Bacteroidetes、酸桿菌門Acidobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、疣微菌門Verrucomicrobia、硝化螺旋菌門Nitrospirae、放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、藍藻門Cyanobacteria。半夏連作下根際土壤細菌在門和種水平的變化規律如圖4所示。由圖4-a可知，正茬、連作一茬和連作三茬處理中變形菌門Proteobacteria、浮霉菌門Planctomycetes和酸桿菌門Acidobacteria為優勢菌群，而連作二茬中優勢菌群為變形菌門Proteobacteria、浮霉菌門Planctomycetes和擬桿菌門Bacteroidetes。隨著連作茬數的增加，變形菌門Proteobacteria所占比例逐漸增加，且在不同處理中塊莖膨大期和成熟期所占比例較出苗期均增加。

圖4 半夏連作下根際土壤細菌在門(a) 和種(b) 水平的變化規律

細菌種水平的分析結果表明（圖4-b）正茬、連作一茬處理下硫桿菌sp.和為優勢菌群；連作二茬處理中硫桿菌sp.、果膠桿菌和所占比例最高。果膠桿菌在正茬中只出現在成熟期，且隨著連茬次數的增加所占比例增加，在連作二茬莖膨大期所占比例最大為28.35%。

綜上所述，隨著半夏連茬次數的增加，細菌群落及相對豐度發生變化連作導致土壤微生物群落結構逐漸發生偏移，并且某些潛在病原菌群落如果膠桿菌在重茬半夏根際土壤中豐度增加。不同連作茬數下，半夏根際土壤微生物群落結構存在較大差異。

3.3 半夏連作對根際土壤真菌群落的影響

對12個半夏連作根際土壤樣品進行測序并通過Barcode識別后共獲得真菌185 251條CCS序列，每個樣品至少產生11 910條CCS序列，平均產生15 438條CCS序列。不同連作年限半夏優勢根際真菌群落采用Mothur方法進行97%相似水平下的OTU分類，并使用UNITE（真菌）分類學數據庫對OTU序列進行相似性比對。獲得真菌OTU數883個，分類學地位明確的真菌有11個門，30個綱、60個目、107個科、180個屬、229個種。

3.3.1 根際土壤真菌α多樣性指數分析 半夏不同連茬次數下根際土壤真菌豐度和多樣性的變化規律如圖5所示。由圖5-a可知，連作初期（30 d），半夏根際土壤真菌ACE指數隨連茬次數的增加先下降后上升，隨著時間的延長（90 d），真菌豐度則逐漸增加。對于Shannon指數則隨著連茬次數的增加呈現出持續下降的趨勢（圖5-b），表明連作導致土壤中真菌多樣性降低。

3.3.2 根際土壤真菌群落β多樣性 真菌OTU聚類發現，正茬和連作一茬處理下半夏出苗期和塊莖膨大期的土壤真菌可聚為一類，而連作二茬和連作三茬處理可聚為另一類（圖6-a）。主成分分析表明，正茬和連作一茬處理下真菌在PC1和PC2上均有相似的離散度，連作二茬和連作三茬處理離散度差異大（圖6-b）。由此表明，半夏連作會影響其根際真菌群落多樣性，且隨連茬次數的增加真菌多樣性的差異較正茬越來越明顯。半夏連作過程中，真菌多樣性的變化主要表現在連作一茬后。

圖5 半夏不同連茬次數下根際土壤真菌群落豐度(a) 和多樣性指數(b)

圖6 半夏連作下根際土壤真菌UPGMA聚類樹(a)和PCA分析(b)

3.3.3 根際土壤真菌組成分析 根據物種注釋的結果，不同連茬次數半夏根際土壤真菌相對豐度最高的10個真菌類相同，分別為子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、壺菌門Chytridiomycota、毛霉門Mucoromycota、絲孢菌門Mortierellomycota、球囊菌門Glomeromycota、捕蟲霉門Zoopagomycota、真菌門Cryptomycota、油壺菌門Olpidiomycota、蟲孢子門Entomophthoromycota，其所占比例存在差異。門水平的分析結果表明（圖7-a），與正茬相比，隨著連茬次數的增加，子囊菌門Ascomycota所占比例增加，壺菌門Chytridiomycota、球囊菌門Glomeromycota和捕蟲霉門Zoopagomycota則呈下降趨勢。正茬處理中，子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、壺菌門Chytridiomycota為優勢種群。隨著連茬次數的增加，優勢種群逐漸演變成子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota和毛霉門Mucoromycota。種水平的分析結果表明（圖7-b），少孢節叢孢菌、鐮刀菌屬真菌和瓜亡革菌所占比例隨著連茬次數的增加而增加；球黑孢霉隨著連茬次數的增加逐漸成為優勢菌群。

圖7 半夏連作下根際土壤真菌在門(a)和種(b) 水平的變化規律

綜上所述，隨著連茬次數的增加，半夏根際土壤中真菌群落結構發生變化，某些潛在病原菌群落如子囊菌門Ascomycota、鐮刀菌屬真菌和瓜亡革菌所占比例逐漸增加，有益真菌群落如球囊菌門Glomeromycota則逐漸減少。連作導致土壤真菌群落及相對豐度發生變化，是導致半夏連作障礙形成的重要原因之一。

4 討論

土壤微生物群落與土壤理化性質緊密相關，且相互影響。大量研究發現，連作會導致土壤酸化[16]，但本研究發現土壤pH隨著半夏生長周期的延長呈先減少后增加的變化趨勢。土壤pH的變化對根際微生物群落產生重要影響，除真菌喜酸外，細菌主要生活在酸性至中性環境，放線菌則適宜中性至堿性環境。半夏出苗后根際土壤的pH持續下降，可能與其根系分泌的有機酸如酚酸類等物質[17]有關。隨著生長周期的延長，pH持續上升，這可能與半夏次生代謝產物如生物堿等物質分泌[18]增加有關。在對不同處理細菌群落進行聚類分析后發現，不同處理相同周期其細菌群落相似度高，結合不同生長周期pH的變化規律可推測根系分泌物、根際土壤pH和細菌群落結構變化具有相關性。但pH的變化是受微生物、根系分泌物的影響，還是其交互作用，具體作用機理需進一步探索。

土壤微生物結構穩定性和功能多樣性對維持土壤系統健康有非常重要的作用，而土壤微生物結構和活性的穩定性取決于微生物多樣性[19]。本研究結果表明，隨著半夏連茬次數的增加，根際土壤細菌和真菌多樣性均降低。在連作過程中，球黑孢霉隨著連茬次數的增加逐漸成為優勢菌群。吳琪[20]研究發現球黑孢霉可引起葉斑、葉枯、鞘腐，并侵染根和匍匐莖。半夏在連作過程中易患葉斑病，可能與球黑孢霉群落數的增加有關。鐮刀屬真菌是多種植物根腐病的主要致病菌[21]，本研究發現鐮刀屬真菌作為不同連作處理中的優勢菌群，且在連作二茬處理中所在比例增加最為明顯。瓜亡革菌是一種寄主范圍很廣的病原菌，為半知菌立枯絲核菌的有性形態[22]。本研究發現隨著連茬次數的增加而增加，瓜亡革菌增加。通過前期田間試驗觀察發現，半夏根腐病主要發生在莖膨大期及成熟期，這可能與該時期中致病菌的增加有關。

綜上，本研究通過對半夏在正茬（CK）、連作一茬（A）、連作二茬（B）、連作三茬（C）處理下，在半夏出苗期（播種后30 d)、塊莖膨大期（60 d）和塊莖成熟期（90 d）3個生長期根際土壤微生物進行細菌16S rRNA和真菌ITS rRNA全長測序，揭示了半夏不同連作次數下不同生長期間根際土壤微生物群落變化規律。隨連作茬數增加，根際土壤有益微生物豐度減少、有害微生物豐度增加，有害真菌逐漸成為優勢菌群，根際土壤微生物群落多樣性降低；半夏的生長時期對根際細菌和真菌多樣性及pH的變化影響較大，致病菌多發生在半夏塊莖膨大期和成熟期，為探索半夏連作障礙機理提供重要依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of continuous cropping ofon rhizospheric microbial community

LIU Shi-rong1, 2, WANG Hong-lan2, SUN Hui3, YANG Ping2, JIANG Shun-yuan2,JIANGGui-hua1

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China 3. Department of Environmental Science and Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China

Response of continuous cropping ofto rhizospheric microbial community is of great significance for realizing the industrialized cultivation ofPacBio Sequel platform was used to conduct sequencing studies on the differences of rhizospheric microbial community and diversity ofat different growth stages under the different treatments of the first cropping (CK), the first continuous cropping (A), the second continuous cropping (B), and the third continuous cropping(C).(1) As the number of continuous cropping ofincreases, the abundance of potential pathogenic bacteria and fungi increased, such as, Ascomycota,andetc.gradually became the dominant flora as the number of consecutive stubbles increased the abundance of beneficial fungi such as Glomeromycota decreased. (2) As the number of continuous cropping ofincreases, the diversity of bacteria and fungi in the rhizosphere soil ofdecreased. (3) The different growth periods ofhave obvious effects on the pH of the rhizosphere soil, which leads to changes in the diversity and functional groups of rhizosphere bacteria and fungi. Some pathogenic fungi such asbecame dominant groups during the tuber expansion and maturity stages of.The change in the structure and biodiversity of rhizospheric microbial community caused by the increase in the number of continuous cropping of, the decrease of beneficial microbe abundance, the increase of harmful microbe abundance, and the decrease of microbial community biodiversity are important reasons for the continuous cropping obstacles of.

(Thunb.) Breit.;continuous cropping; rhizosphere soil; PacBio sequel sequencing; microbial diversity; communitystructure

R286.2

A

0253 - 2670(2022)04 - 1148 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.023

2021-05-06

國家科技部重大研發計劃課題（2019YFC1712305）；國家科技部重大研發計劃課題（2019YFC1712302）；四川省社會發展重點研發項目（2018SZ0090）；四川省科技廳應用基礎研究項目（2020YJ0369）；2019年醫療服務與保障能力提升補助資金（中醫藥事業傳承與發展部分）（財社［2019］39號）

劉詩蓉（1995—），碩士研究生，主要從事中藥資源與開發研究。E-mail: 1310520171@qq.com.

蔣桂華，教授，主要從事中藥品種與質量研究。E-mail: 11469413@qq.com

王紅蘭，助理研究員，主要從事土壤生態環境與中藥材質量研究。Tel: (028)87428339 E-mail: honglanwang2010@126.com

[責任編輯 時圣明]