轉鈷胺1在結直腸癌及其肺轉移組織中的表達及臨床意義

劉永斌 王成 劉延杰 劉芳 岳萌 呂菲 劉廣杰 王貴英

Transcobalamin 1(TCN1)是一種維生素B12(鈷胺素)轉運蛋白，參與體內鈷胺素的轉運和代謝。有研究顯示，TCN1在多種腫瘤病人的血液和腫瘤組織中高表達。生物信息學分析發現，TCN1在多種實體癌組織中高表達，并且與腫瘤侵襲性生物學行為和不良預后有關[1]。本研究擬探討結直腸癌(colorectal cancer,CRC)病人原發腫瘤、肺轉移瘤及配對正常組織中TCN1的表達狀況，分析CRC病人腫瘤組織中TCN1表達水平與病人臨床特點、以及化療敏感性的相關性。

對象與方法

一、對象

2009年5月～2019年1月我院收治的CRC肺轉移病人42例。男性29例，女性13例。年齡<60歲19例，≥60歲23例。根據2003年修改的國際抗癌聯盟(UICC)和美國腫瘤聯合會(AJCC)聯合制訂的TNM分期法進行分期：CRC浸潤深度T1 0例,T2 2例,T3 4例,T4 36例。N0 20例，N1 13例，N2 9例，其中Ⅰ期2例，Ⅱ期14例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。非同期發現CRC肺轉移病人32例，其中CRC術前接受新輔助化療病人19例，未行術前新輔助治療病人13例。同期轉移10例。見表1。

二、方法

1.信息收集：包括性別、年齡、TNM分期、肺轉移癌直徑大小、是否接受新輔助(奧沙利鉑加氟尿嘧啶類)化療、TCN1表達水平及病人生存狀況。

2.病理組織信息：包括結腸鏡活檢組織、手術中獲得的CRC及癌旁正常黏膜組織、肺轉移癌組織及配對正常肺組織。

3.蘇木-曙紅(HE)染色和免疫組織化學(immunohistochemical，IHC)：HE染色用于診斷，IHC用于檢測TCN1在不同組織中的表達。TCN1多克隆抗體購于ABclonal公司。陽性腫瘤細胞比例及染色強度分別賦分計算，最終IHC得分以兩者計分乘積計算。組織染色方法為HE染色。評價標準：染色陽性的腫瘤細胞比例賦分為:0(無腫瘤細胞染色)、1(腫瘤細胞顯色數<25%)、2(腫瘤細胞顯色數25%～50%)、3(腫瘤細胞顯色數50%～75%)、4(腫瘤細胞顯色數75%～100%)。染色強度分級賦分按3(棕=強染色)、2(黃棕色=中度染色)、1(淡黃色=弱染色)、0(無染色)進行評價。最終表達水平得分數等于腫瘤細胞顯色比例和染色強度得分乘積。評分0～2分視為TCN1陰性表達，3分以上為TCN1陽性表達，將表達水平得分<6判定為低表達組，評分≥6分判定為高表達組。所有病理切片均隱去病人臨床資料，由兩名經驗豐富的病理科醫師獨立進行讀片。結果不一致時以染色較低的分數計，避免人為造成過度判斷所致的假陽性。

三、統計分析

應用SPSS 21.0軟件分析數據，CRC組織與癌旁組織、配對肺轉移組織與正常肺組織之間的TCN1表達差異，TCN1表達與臨床病理的特征之間的相關性使用χ2檢驗或Fisher檢驗。化療前后及結腸鏡活檢組織與術后標本中TCN1表達情況應用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.TCN1表達與CRC組織、肺轉移組織臨床病理特征的關系見表1。結果表明，CRC組織中TCN1表達與淋巴結轉移、TNM分期顯著相關。與病人性別、年齡、腫物侵犯深度無明顯相關性。見表2。肺轉移組織中TCN1表達強弱在性別、年齡、轉移瘤大小間差異均無統計學意義。

表1 CRC組織中TCN1表達與病人臨床病理特征的關系(例)

表2 CRC肺轉移組織中TCN1表達狀況(例)

2.TCN1在CRC組織、肺轉移癌組織及癌旁組織的表達情況：對42例CRC及配對的癌旁組織進行HE染色和IHC。HE染色用于診斷，IHC用于檢測TCN1在不同組織中的表達，組織染色陽性代表圖(圖1)。在42例CRC組織中高表達23例(54.7%，23/42)，陽性表達率為76.1%(32/42)，配對的癌旁正常黏膜組織高表達0例，陽性表達率為9.5%(4/42)。相應的42例CRC肺轉移癌組織中，肺轉移癌組織高表達25例(59.5%，25/42)，陽性表達率為83.3%(35/42)，其配對的肺正常組織，高表達0例，陽性表達率為4.7%(2/42)，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。但在CRC組織與肺轉移性腫瘤組織中，CRC組織與肺轉移癌組織中TCN1表達水平相似，二者間TCN1表達水平比較差異無統計學意義(圖2a)。

A.正常結腸組織(HE×100)；B.TCN1在結腸癌組織中低表達(sp，x400)；C.TCN1在結腸癌組織中高表達(sp，x400)；D.正常肺組織切片(HE×100)；E.TCN1在結直腸癌肺轉移組織中低表達(sp，x400)；F.TCN1在結直腸癌肺轉移組織中高表達(sp，x400)

表3 TCN1在癌組織和癌旁組織中表達情況比較(例)

a.CRC與CRC肺轉移癌組織；b.新輔助化療前后CRC組織；c.結腸鏡活檢標本與手術標本組織圖2 不同組織中TCN1表達水平比較

3.化療前后及結腸鏡活檢組織與手術切除組織中TCN1表達情況：本組42例病人中，32例為非同期發現CRC肺轉移病人，其中19例在行CRC切除術前進行了奧沙利鉑加氟尿嘧啶類化療藥物新輔助化療，13例病人未行術前化療。行新輔助化療組的CRC轉移中位時間為32個月(10～74個月,95%CI:27.0512～47.2646)；未行化療組CRC轉移中位時間為20個月(8～44個月；95%CI:16.2942～47.2646)。兩組轉移時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。19例新輔助化療病人化療前結腸鏡活檢組織與化療后手術切除腫瘤組織中免疫組化得分由新輔助化療前(4.05±2.24)分降低為(2.47±2.0)分，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05，圖2b)。結腸鏡活檢組織標本TCN1免疫組化表達水平為(4.38±2.35)。23例未行化療的病人手術切除組織中TCN1表達水平為(4.65±2.46)，兩者相比,差異無統計學意義(P>0.05，圖2c)。

討論

現階段結直腸癌病人微衛星不穩定性、KRAS、BRAF、HER-2等檢測為個體化治療提供了分子基礎[2]。臨床上也在積極探索CRC治療療效評價和治療耐藥監測。從循環腫瘤細胞到蛋白，從mRNA、lncRNA、cirRNA到外泌體以及基因位點突變，在各個領域不斷探索，以期找到敏感指標，評價治療效果[3]。

盡管對于CRC的治療有重大進展，許多CRC病人仍舊無法逃脫遠處轉移和復發的命運，特別是CRC肺轉移病例數的不斷增加，嚴重影響病人長期預后。另一方面，CRC病人化療敏感性評價也缺乏敏感指標。因此，臨床上不斷致力于尋找新的預測性生物標志物，用于CRC進展和轉移的早期監測。

TCN1是一種Cobalamin(Vitamin B12)轉運蛋白，可將鈷胺素從胃運輸到腸道。它主要存在于細胞質中，并與TCN2和內在因子在VitB12的運輸，代謝和維持體內VitB12平衡過程中發揮的作用，尤其是在維持造血和神經系統功能方面意義重大[4-5]。有研究發現，人類多種癌癥病人血清中維生素B12和TCN1表達水平異常，高濃度鈷胺素和TCN1與白血病、肝細胞癌和乳腺腫瘤的葉狀細胞有關，在某些實體瘤中已檢測到TCN1的上調[6-7]。TCN1可以通過TCN1表達水平來區分乳腺分界和惡性腫瘤與乳腺葉狀腫瘤，腫瘤組織中高水平的TCN1與腫瘤的發生和不良的生物學行為有關[8]。有研究顯示，TCN1可能是下咽鱗狀細胞癌和接受化療的直腸癌的一種新型不良預后生物學標志物。研究發現，TCN1是CRC中是排名靠前的差異表達基因[4,8]。生物信息學數據挖掘也發現TCN1是一種原癌基因，可用于區分正常結直腸組織和CRC[4]，有證據表明TCN1參與了眾多腫瘤的發生和發展[3]。

本研究結果證實TCN1在CRC組織中呈高表達，其表達水平隨腫瘤惡性生物學行為相關，隨分期增加逐漸升高。TCN1在肺轉移癌組織中也呈現高表達狀態，其表達水平與原發性CRC的表達水平一致。 因此，我們推測TCN1在CRC的進展和轉移中發揮了潛在作用。Lee等[6]發現，TCN1在直腸癌中過表達，其表達水平與晚期腫瘤治療、淋巴結狀態、血管浸潤和腫瘤消退等級有關。 Wu等[9]報道，TCN1在胰腺癌中高表達，與我們的研究結論一致。

有研究表明，TCN1與新輔助化療和同步放化療敏感性相關，并預測TCN1可能是監測耐藥性的潛在生物標志物[6-7]。Lee等[6]用TCN1評價新輔助化療的敏感性，發現TCN1表達水平與治療療效和腫瘤消退分級相關。敏感的生物標志物可以用于篩選化療藥物，評價治療療效。本研究發現，CRC病人腸鏡活檢組織與術后標本的TCN1表達水平一致，說明可以利用腸鏡活檢組織代替手術標本用于TCN1檢測。

CRC病人應用奧沙利鉑加氟尿嘧啶新輔助化療后CRC組織TCN1表達水平下降，說明抗腫瘤藥物會影響組織中TCN1的表達。因此，這部分研究提示TCN1有可能作為篩選敏感化療藥物的生物標志物。但有必要擴大樣本量及進一步進行前瞻性實驗，以驗證該結果并確定TCN1表達變化與預后之間的關系。