miR-181c-5p靶向TRIM71調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡研究

邊紅芝 韓俊壘 胡建平 丁成智

肺癌是癌癥相關(guān)死亡率的主要原因，其5年生存率一直很差[1]。盡管監(jiān)測和臨床治療策略有所改善，但美國的5年總生存率仍約為16%[2]。2012年，全世界有180萬人罹患肺癌，導(dǎo)致160萬人死亡。不幸的是，其總發(fā)病率在世界范圍內(nèi)急劇增加[3]。大多數(shù)肺癌臨床病例分為兩種亞型：小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[4]。大約70%的新診斷為肺癌亞型的患者在切除后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性病變[5]。毫無疑問，闡明肺癌的發(fā)病機(jī)理對于有效治療該疾病很重要。MicroRNA(miRNA)是一類短的，內(nèi)源性的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。盡管miRNA僅占表達(dá)基因組的一小部分，但已證明它們在各種細(xì)胞過程中具有重要作用，包括增殖，凋亡，分化和惡性轉(zhuǎn)化[7]。據(jù)估計(jì)，有60%的基因受miRNA調(diào)控，miRNA表達(dá)的變化會影響生理和病理過程[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織和正常肺組織的miRNA表達(dá)差異極大，并且已經(jīng)鑒定出一些在肺癌發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵功能的miRNA[9]。然而，仍然有許多miRNA的功能亟待剖析，包括miR-181c-5p。基于此，本研究旨在探討miR-181c-5p調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HLF-a(人肺細(xì)胞)和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549均購自procell(貨號：CL-0359、CL-0016)。miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor、siRNA均由吉凱基因合成。TRIM71的過表達(dá)載體由A549 cDNA擴(kuò)增片段后連接至PCDNA3.1載體上。RevertAidHMinus第一鏈cDNA合成試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號：TER016-1)。SYBR Green PCR Master Mix購自廣州一科生物科技有限公司(貨號：RBWG5-10 ml,400T)。pmiR-RB-REPORTTM載體購自銳博生物。RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號：P0013B)。Lipofectamine 3000購自上海齊正生物科技有限公司(貨號：L3000008)。泛素蛋白酶體抑制劑MG132購自selleck(貨號：S2619)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HLF-a使用MEM培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%雙抗)培養(yǎng)，A549使用DMEM培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%雙抗)培養(yǎng)。miR-181c-5p mimics、miR-181c-5p inhibitor、siRNA和質(zhì)粒均用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染。泛素蛋白酶體抑制劑MG132的使用終濃度為20 μM。

1.2.2 RNA抽取與實(shí)時熒光定量PCR 按照制造商的說明，使用Trizol試劑提取總RNA。通過分光光度法定量后，使用1 μg總RNA通過RevertAidHMinus第一鏈cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix在Applied Bio-system 7500儀器上進(jìn)行實(shí)時PCR分析。所有反應(yīng)均按照以下程序進(jìn)行：95 ℃ 3 min，在95 ℃下進(jìn)行42個循環(huán)30 s，在60 ℃下進(jìn)行30 s退火，并在72 ℃下延伸40 s。用2-△△CT法計(jì)算靶基因的相對表達(dá)。使用U6或GAPDH作為內(nèi)部對照對CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。特異性引物如下：miR-181c-5p，(正向)5-GGGAACATTCAACCTGTCG-3和(反向)5-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3；U6，(正向)5-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3和(反向)5-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3；GAPDH，(正向)5-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3和(反向)5-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3。

1.2.3 免疫印跡 將腫瘤組織或細(xì)胞在冰冷的磷酸鹽緩沖液中沖洗，并在RIPA裂解緩沖液中裂解以收集蛋白質(zhì)。將樣品以12000 g離心20 min，并通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度。等量的蛋白質(zhì)在12%SDS-PAGE上電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜1小時。隨后，將膜與一抗(TRIM71,p53,GAPDH)，然后與結(jié)合HRP的二抗用于檢測蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物。GAPDH用作對照蛋白以定量相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.2.4 熒光素酶報告實(shí)驗(yàn) 通過插入TRIM71 mRNA的3-UTR片段來構(gòu)建pmiR-RB-REPORTTM載體，該片段包含推定的miR-181c-5p結(jié)合位點(diǎn)。 作為突變載體，TRIM71的3-UTR片段的種子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了突變，從TGAATGT到ACTTACT。為了進(jìn)行報告基因分析，使用Lipofectamine 3000將100 ng野生型或突變質(zhì)粒和50 μnM miR-181c-5p mimics或陰性對照轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時使用Dual-GloTM熒光素酶測定系統(tǒng)測量螢火蟲和海腎熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)一式兩份進(jìn)行，并重復(fù)至少三遍。組間差異通過t檢驗(yàn)進(jìn)行評估，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-181c-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡

miR-181c-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)水平低于人正常肺細(xì)胞HLF-a(P<0.05)，見圖1A。轉(zhuǎn)染miR-181c-5p mimics過表達(dá)miR-181c-5p后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡上升(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-181c-5p inhibitor敲低miR-181c-5p后，發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡下降(P<0.05)，見圖1B。

圖1 miR-181c-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡

2.2 miR-181c-5p靶向TRIM71

通過miRDB在線分析，發(fā)現(xiàn)miR-181c-5p潛在靶向74個基因。基于此，在A549細(xì)胞中過表達(dá)miR-181c-5p后，通過實(shí)時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)有15個基因的表達(dá)水平被調(diào)節(jié)了6倍以上(P<0.05)，見圖2A。通過siRNA敲低上述15個基因后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低TRIM71時，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平上升(P<0.05)，見圖2B。過表達(dá)TRIM71后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平下降(P<0.05)，見圖2C。過表達(dá)miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平下降；而敲低miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平上升，見圖2E和圖2F。此外，miR-181c-5p靶向TRIM71 mRNA的3端非編碼區(qū)(P<0.05)，見圖2D。

圖2 miR-181c-5p靶向TRIM71

2.3 miR-181c-5p抑制TRIM71泛素化P53

敲低TRIM71后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平上升；而過表達(dá)TRIM71后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平下降，見圖3A和圖3B。過表達(dá)miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平上升；而敲低miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平下降，見圖3C和圖3D。泛素蛋白酶體抑制劑MG132處理后，過表達(dá)miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平?jīng)]有明顯變化；敲低miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平?jīng)]有明顯變化，見圖3E和圖3F。

圖3 miR-181c-5p抑制TRIM71泛素化p53

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，并且仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[10]。盡管有諸如靶向治療等巨大成就，但是，找到一種徹底治愈肺癌的方法仍然是一個挑戰(zhàn)。腫瘤的發(fā)展是一個復(fù)雜而復(fù)雜的過程，可能會受到環(huán)境或個人因素的影響。盡管已經(jīng)廣泛研究了與腫瘤相關(guān)的致癌因素，但促成腫瘤發(fā)生的潛在機(jī)制仍然難以捉摸。因此，確定此類機(jī)制至關(guān)重要。

miRNA是一類小的非編碼RNA，參與多個細(xì)胞生物學(xué)過程，包括上皮到間質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。miRNA通過與目標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平來抑制基因[12]。新興證據(jù)表明，可以通過抑制或過表達(dá)某些miRNA的水平來在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展[13]。因此，miRNA可能成為有希望的癌癥治療靶點(diǎn)。在本研究中，miR-181c-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中的表達(dá)水平低于人正常肺細(xì)胞HLF-a(P<0.05)。過表達(dá)miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡上升(P<0.05)；敲低miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡下降(P<0.05)。已有研究表明miR-181c-5p的過表達(dá)加劇了缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，并加劇了缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[14]。本研究并未給予A549細(xì)胞缺氧條件，但是miR-181c-5p依舊促進(jìn)了凋亡，提示miR-181c-5p在腫瘤細(xì)胞和心肌細(xì)胞中的促凋亡機(jī)制并不相同。miR-181家族包含四個miRNA(miR-181a，miR-181b，miR-181c和miR-181d)，它們被發(fā)現(xiàn)具有高度同源性，并在體內(nèi)廣泛分布[15]。除了miR-181c-5p，miR-181家族的其他是否也與細(xì)胞凋亡相關(guān)仍然值得探討。

miRDB在線分析發(fā)現(xiàn)miR-181c-5p潛在靶向74個基因。過表達(dá)miR-181c-5p后，發(fā)現(xiàn)有15個基因的表達(dá)水平被調(diào)節(jié)了6倍以上(P<0.05)。敲低上述15個基因后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲低TRIM71時，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平上升(P<0.05)。過表達(dá)TRIM71后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡水平下降(P<0.05)。過表達(dá)miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平下降；而敲低miR-181c-5p后，TRIM71的蛋白水平上升。此外，miR-181c-5p靶向TRIM71 mRNA的3端非編碼區(qū)(P<0.05)。TRIM71是Trim-NHL蛋白家族的成員[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)TRIM71能夠通過泛素化降解p53[17]。因此，A549細(xì)胞可能存在miR-181c-5p/TRIM71/p53調(diào)控軸以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中，敲低TRIM71后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平上升；而過表達(dá)TRIM71后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平下降。過表達(dá)miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平上升；而敲低miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平下降。泛素蛋白酶體抑制劑MG132處理并過表達(dá)miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平?jīng)]有明顯變化；泛素蛋白酶體抑制劑MG132處理并敲低miR-181c-5p后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的p53水平?jīng)]有明顯變化。由p53誘導(dǎo)的凋亡被牢固地確立為腫瘤抑制的主要機(jī)制[18]。除了其作為核轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)雜功能外，p53還可以在細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體中發(fā)揮作用，通過不依賴轉(zhuǎn)錄的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-181c-5p通過靶向TRIM71 mRNA的3端非編碼區(qū)后減少了TRIM71的表達(dá)水平，隨后凋亡活化基因p53的蛋白水平上升，最后促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的凋亡。