甲氰菊酯對大鼠格列喹酮口服吸收及腸道緊密連接蛋白表達的影響

徐 莉，劉 揚，楊 曄，2，3，芮雪琳，李嘉誠，尹登科，2，3

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫學教育部重點實驗室，安徽合肥 230012；3.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

甲氰菊酯（fenpropathrin，Fen）是一類具有光穩定性的擬除蟲菊酯類農藥，其殺蟲譜廣，持效期長，防治效果好，適合在害蟲、害螨并發時使用，被廣泛應用于蔬菜水果等農作物及中藥材中防治鱗翅目、同翅目、半翅目、鞘翅目等害蟲及螨蟲［1］，因此農產品及中藥材上的農藥殘留可能使人類長期處于低劑量暴露狀態。格列喹酮（gliquidone，Gli），商品名糖適平，是第二代磺酰脲類口服降血糖藥物，與第一代相比，其與磺脲類受體結合力更強，可促進胰腺β細胞釋放內源性胰島素，有效降低血糖［2-3］。Gli腸道吸收快，絕大部分經膽汁排泄，尤其適用于腎功能不全的患者［4］。Gli治療應用的時間較長，具有所需劑量小、不良反應少的優點，因此在臨床使用中仍較為穩定和廣泛［5］。臨床使用Gli的主要不良反應是低血糖，產生這種不良反應的原因難以直接判斷，而糖尿病患者血糖變化與Gli血藥濃度密切相關［6］，所以藥物的相互作用及其他原因造成的Gli血藥濃度增加或蓄積通常被認為是其誘發低血糖的因素之一［3，7-8］。患者在長期使用治療藥物時，除同時使用的其他臨床藥物，機體內蓄積的環境污染物引起的機體變化也可能導致藥物吸收異常［9］。Fen的急性毒性已有明確記錄［10-11］，而Fen長期低劑量暴露對Gli的吸收是否產生影響尚不清楚。根據聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織規定，Fen的日容許攝入量（allowable daily intake，ADI）為0.03 mg·kg-1，根據公式ADI=無可見有害作用水平（no observed adverse effect level，NOAEL）/安全系數，通常取安全系數為100，換算出Fen的NOAEL為3 mg·kg-1［12-13］。根據成人每日臨床劑量（2.5 mg·kg-1）以及人與大鼠間的劑量換算，確定Gil劑量為15 mg·kg-1。本研究觀察Fen 3 mg·kg-1對Gli 15 mg·kg-1在大鼠體內藥動學參數及腸道緊密連接蛋白表達的影響，為Fen暴露對藥物吸收影響提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

Gli標準品（含量≥98%，批號0830A02）和羧甲纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）（批號116Q022），北京索萊寶科技有限公司；Fen標準品（含量≥98%，批號20200317），北京中科質檢生物技術有限公司；Gli（批號D07F6J1），上海源葉生物科技有限公司。肝素鈉注射液（批號152007040A），常州千紅生化制藥股份有限公司；二氯甲烷（批號20200619），國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（批號20110508G103，色譜純）和乙腈（批號20100628G104，色譜純），瑞典Oceanpak公司；兔抗大鼠密封蛋白1（claudin-1）抗體（批號 JJ1210）、兔抗大鼠閉合蛋白（occludin）抗體（批號JJ1210）和Cy3-山羊抗兔IgG抗體（批號KK0406），成都正能生物技術有限責任公司；兔抗大鼠閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens protein-1，ZO-1）抗體（批號 BJ07087592），北京博奧森生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（批號2117D0107）和DAB顯色試劑盒（批號2060A0824），北京中杉金橋生物技術有限公司。

Ultimate 3000高效液相色譜，美國賽默飛世爾科技有限公司；Hypersil BDS C18色譜柱，大連依利特公司；220-A型數顯電熱恒溫干燥箱，上海陽光實驗儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；ZXZ-Z型循環水式真空泵，河南一恒儀器有限公司。

1.2 動物

健康SD大鼠15只，雌雄不限，SPF級，體重230～270 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（皖）2017-001。飼養環境溫度為18～26℃,光照12 h，黑暗12 h，自由飲水及飲食。本研究通過安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批，動物倫理編號為AHUCM-rats-2021043。

1.3 血漿樣品處理及分析

大鼠眼眶靜脈叢取血，分離血漿200 μL，加入二氯甲烷1 mL，渦旋混勻3 min，1600×g離心10 min，吸取有機層，50℃氮氣吹干后用100 μL流動相復溶，14 000×g離心15 min，取20 μL上清進樣進行高效液相色譜分析。色譜條件為：Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（65∶35，V∶V）；柱溫：25℃；波長：310 nm；進樣量：20 μL；進樣時間：10 min；流速：1 mL·min-1。

1.4 樣品分析方法驗證

1.4.1 專屬性

空白大鼠眼眶靜脈叢取血得空白血漿，空白血漿內加入0.25 mg·L-1Gli標準品，得含藥標準血漿樣品，大鼠ig給予Gli 15 mg·kg-130 min后眼眶取血得給藥后樣品，將空白血漿、含藥標準血漿樣品、大鼠給藥后血漿樣品以1.3方法處理進樣，考察血漿內源性物質是否干擾Gli檢測。

1.4.2 殘留效應

配置Gli高濃度（10 mg·L-1）以及定量下限（0.25 mg·L-1）標準血漿樣品。進樣高濃度樣品檢測后，進空白樣品及定量下限樣品。空白樣品中Gli的測定信號與定量下限樣品測定信號的比值應≤20%。

1.4.3 標準曲線

配制含標準品 Gli 0.25，0.5，1.0，2.5，5.0 和10.0 mg·L-1的標準血漿樣品，經1.3方法處理進樣。以峰面積為y，藥物濃度為x，繪制標準曲線。

1.4.4 精密度和準確度

空白血漿加Gli標準品溶液，配制成質量濃度0.5，2.5和10.0 mg·L-1的標準血漿樣品，每濃度設5個平行樣。按1.3方法處理進樣。計算各濃度平行樣品測定結果的日內相對標準差（relative standard deviation，RSD）。樣品重復測定3 d，計算測定結果的日間RSD，代表精密度。根據峰面積代入標準曲線計算Gli的濃度，測得濃度與實際濃度之比計算準確度。

1.4.5 穩定性

空白血漿加入Gli標準品溶液，配制成0.5，2.5和10.0 mg·L-1標準血漿樣品，每濃度5個樣品。室溫放置24 h和-20℃放置1周后，按1.3方法處理進樣，測定各樣品的實測濃度，計算測定結果的RSD和相對誤差（relative error，RE）。

1.5 藥動學測定

取15只SD大鼠隨機分為玉米油組、Gli組和Fen+Gli組，每組5只。Gli用1%CMC-Na配制為1.5 g·L-1混懸液，Fen用玉米油溶解配制為3 g·L-1溶液。大鼠適應性喂養1周后，Gli組ig給予玉米油 1 mL·kg-1，14 d后 ig給予 Gli混懸液10 mL·kg-1；Fen+Gli組 ig 給予 Fen 玉米油溶液14 d后，ig給予Gli混懸液10 mL·kg-1。玉米油組僅ig給予等體積玉米油。大鼠在ig給予Gli前禁食12 h，自由飲水，ig給予 Gli后，分別于 0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0和8.0 h經眼眶靜脈叢取血0.5 mL置肝素抗凝管中，離心10 min（900×g）取上清，按1.3方法處理，檢測Gli血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線圖，并采用DAS 2.0軟件計算藥時曲線下面積（area under the curve，AUC）、清除率（clearance rate，CL）、消除速率常數（elimination rate constant，Ke）、吸收速率常數（absorption rate constant，Ka）、半衰期（eliminate half life，t1/2）、達峰時間（peak time，Tmax）和峰濃度（maximum plasma concentration，Cmax）等藥動學參數。

1.6 HE染色法觀察大鼠小腸組織形態

1.5中Gli組、Fen+Gli組和玉米油組大鼠取血結束后立即處死，取小腸組織用4%多聚甲醛固定、包埋、切片，切片用染液染色，顯微鏡下觀察大鼠小腸組織形態。

1.7 免疫組化和免疫熒光法檢測大鼠小腸組織中緊密連接蛋白的表達

取1.6中Gli組、Fen+Gli組和玉米油組大鼠小腸組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，枸櫞酸緩沖液抗原修復后PBS溶液沖洗，加內源性過氧化物酶阻斷劑，孵育20 min，PBS溶液沖洗。山羊血清封閉1 h，甩去血清后，滴加兔抗大鼠密封蛋白1抗體（1∶200），4℃孵育過夜，TBST溶液沖洗。滴加適量辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育20 min，TBST溶液沖洗。滴加適量配制好的DAB顯色劑，顯色10 s。自來水沖洗，蘇木精復染10 s，1%鹽酸分化，溫水返藍。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片，倒置顯微鏡下觀察，采集圖片，棕黃色為陽性表達區域。同樣取小腸組織切片，脫蠟水化，抗原修復后，用0.2%TritonX-100通透20 min，過氧化物酶阻斷，山羊血清孵育，滴加兔抗大鼠閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1抗體（1∶200），4℃下孵育過夜，PBST漂洗，滴加Cy3-山羊抗兔IgG抗體（二抗）（1∶300），37℃避光孵育1 h，PBST漂洗，滴加DAPI染細胞核，室溫避光孵育5 min，PBST漂洗，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為陽性表達區域。采用Image J圖像分析系統分析各組積分吸光度值定量待測蛋白表達水平。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 專屬性

大鼠空白血漿、標準血漿樣品、大鼠給藥后樣品的色譜見圖1。Gli的保留時間為8.7 min，血漿內源性物質不干擾Gli的檢測。

Fig.1 Chromatograms of gliquidone（Gli）in rat plasma.A：blank plasma；B：standard plasma sample containing Gli 0.25 mg·L-1；C：plasma sample acquired 30 min after being ig given Gli 15 mg·kg-1.

2.1.2 殘留

高濃度標準品血漿樣品（10 mg·L-1）進樣后，在空白樣品中的殘留為定量下限的16.72%（＜20%），符合要求。

2.1.3 標準曲線

以Gli的峰面積為y，藥物濃度為x，繪制的標準曲線方程為y=0.1311x+0.0038，R2=0.9989，表明Gli在0.25～10.0 mg·L-1范圍內線性良好，定量下限為0.25 mg·L-1。

2.1.4 精密度和準確度

Gli定量下限（0.25 mg·L-1）及質量濃度（0.5，2.5和10.0 mg·L-1）標準血漿樣品的精密度和準確度見表1。RSD均＜15%，準確度85%～115%，滿足生物樣品分析要求。

Tab.1 Precision and accuracy of analysis method for determination gliquidone

2.1.5穩定性

Gli高、中、低質量濃度（0.5，2.5，10 mg·L-1）的標準血漿樣品的穩定性見表2。RSD均＜15%，RE為-15%～15%，表明Gli在儲存和分析過程中穩定性良好。

Tab.2 Stability of gliquidone in rat standard plasma samples

2.2 Fen對大鼠灌胃Gli藥動學的影響

大鼠ig給予Gli后的藥時曲線見圖2，相關藥動學參數見表3。結果表明，與Gli組大鼠相比，ig給予Fen 14 d后，Fen+Gli組AUC0-t由4.0 mg·L-1·h增加到8.3 mg·L-1·h（P＜0.05），Ka由1.0 h-1增加到14.6h-1（P＜0.05），Cmax由1.3 mg·L-1增加到3.8 mg·L-1（P＜0.05），Tmax由2.80 h縮短到0.90 h（P＜0.05）。2組Ke和半衰期均無顯著性差異。

Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of gliquidone in rat plasma.The SD rats were randomly divided into corn oil control group(ig given corn oil only),Gil group and Fen+Gli group.The Fen+Gli group and the Gli group were ig given 3 mg·kg-1of Fen or an equal volume of corn oil for 14 d,then ig given Gli 15 mg·kg-1and blood was taken from the orbital venous plexus at different time points after administration.The plasma concentration of Gli was detected by high performance liquid chromatography.x±s，n=5.

Tab.3 Effect of fenpropathrin on pharmacokinetic parameters of gliquidone

2.3 Fen對大鼠小腸組織形態的影響

HE染色結果（圖3）表明，與Gli組比較，Fen+Gli組小腸絨毛頂端出現損傷，固有層與腸上皮細胞分離，杯狀細胞減少；Gli組與玉米油組比較無明顯差異。

Fig.3 Effect of fenpropathrin on intestinal morphology and structure by HE staining.See Fig.2 for the rat treatment.Arrows indicate structural damage.

2.4 Fen對大鼠小腸組織緊密連接蛋白表達的影響

大鼠小腸組織緊密連接蛋白表達檢測結果（圖4）顯示，Fen+Gli組大鼠小腸組織中密封蛋白1、閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1表達水平較Gil組均顯著下降（P＜0.05），Gli組與玉米油組比較無顯著差異。

Fig.4 Effect of Fen on protein expressions of claudin-1,occludin and zonula occludens protein-1（ZO-1）in rat intestine by immunohistochemistry.See Fig.2 for the rat treatment.Arrows indicate positive expression.B was the semiquantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with Gil group.

3 討論

本研究結果表明，Fen 3 mg·kg-1長期暴露可影響 Gli藥動學參數，增加 Gli的 AUC0-t，AUC0-∞，Ka，Cmax和Tmax，而未影響Gli的Ke和t1/2。由此推測，2組結果的差異可能主要是由于Fen影響Gli的吸收所致。Fen+Gli組中 Gli的Cmax增加到 3.8 mg·L-1，相當于ig給予大鼠Gli 120 mg·kg-1時的血藥濃度，遠超臨床安全劑量180 mg·d-1換算的大鼠劑量（16 mg·kg-1）［14］。有研究表明，溴氰菊酯暴露誘發了擔尼魚（斑馬魚）腸壁黏膜組織細胞病理改變［15］，Adeyemi等［16］得到了相似結果，即氯氰菊酯暴露引起魚的組織結構改變，如黏膜層嚴重糜爛，固有層退化，肌肉層解體。本研究結果表明，Fen一定程度上損傷了腸道組織屏障，并降低密封蛋白1、閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1這3種緊密連接蛋白的表達，提示Fen對腸道的損傷可能是導致Gli吸收增加的原因。擬除蟲菊酯類農藥的毒性有眾多文獻報道，其對機體造成損傷的一個重要原因是可誘導機體氧化應激導致神經系統、肝和腎等器官的氧化損傷［17］。同時，氧化應激也會導致腸道線粒體功能障礙，細胞間緊密連接破壞和腸細胞凋亡，大規模腸細胞凋亡和細胞間緊密連接中斷也是腸道屏障功能障礙的主要機制。Fen對腸道屏障的損傷作用是否與Fen誘導的氧化應激有關，尚需進一步實驗驗證。

綜上所述，Fen長期暴露增加了Gli的生物利用度和吸收速率，且達峰時間顯著提前，這可能是由于其促進Gli的相關吸收途徑的作用所致，提示Gli口服吸收的個體差異可能與農藥暴露有關。因此，需注意其臨床使用時的飲食和環境安全性，以規避可能導致的低血糖及其他不良反應。