睡菜醋酸乙酯部位化學(xué)成分及其神經(jīng)保護(hù)作用研究

金 冠，何芷蕓#，張志麒，劉呈雄，陳劍鋒，鄒 坤，程 凡*

睡菜醋酸乙酯部位化學(xué)成分及其神經(jīng)保護(hù)作用研究

金 冠1，何芷蕓1#，張志麒2，劉呈雄1，陳劍鋒1，鄒 坤1，程 凡1*

1. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)），湖北 宜昌 443002 2. 神農(nóng)架國家公園管理局，湖北 神農(nóng)架林區(qū) 442400

研究神農(nóng)架產(chǎn)睡菜全草醋酸乙酯部位的化學(xué)成分及其神經(jīng)保護(hù)作用。采用薄層色譜，正相硅膠、AB-8大孔樹脂、Sephadex LH-20葡聚糖凝膠及制備型HPLC等柱色譜方法分離純化，利用NMR、MS等波譜學(xué)方法鑒定化合物結(jié)構(gòu)。采用體外建立皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，就單體化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用進(jìn)行初步確認(rèn)。從睡菜醋酸乙酯部位中得到了21個(gè)化合物，分別鑒定為4--咖啡酰奎尼酸甲酯（1）、綠原酸甲酯（2）、綠原酸（3）、異秦皮素（4）、異嗪皮啶（5）、7,7′,8,8′-(+)-新-橄欖脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷（6）、腫柄雪蓮苷（7）、丁香脂素（8）、蘇式-(7,8)-愈創(chuàng)木基丙三醇-8-香草醛醚（9）、(7,8)-二氫去氫二松柏醇-4--β--吡喃葡萄糖苷（10）、(?)-落葉松脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷（11）、山柰酚-3--蕓香糖苷（12）、槲皮素-3--蕓香糖苷（13）、去氫吐葉醇（14）、布盧門醇A（15）、黑麥草內(nèi)酯（16）、()-6-羥基-2,6-二甲基辛-2,7-二烯酸甲酯（17）、3-甲氧基酚-1--α--吡喃鼠李糖基-(1→6)--β--吡喃葡萄糖苷（18）、2-羥基苯并咪唑（19）、丁香醛（20）、1-苯基-1,2-乙二醇（21）。皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究顯示，化合物1～3、7、9對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，化合物4、5、10、11、15～17表現(xiàn)出中等的保護(hù)作用。化合物1～9、11～12、14～21為首次從該植物中分離得到；部分化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

睡菜；抗焦慮；PC12細(xì)胞；神經(jīng)保護(hù)；4--咖啡酰奎尼酸甲酯；綠原酸；異秦皮素；蘇式-(7,8)-愈創(chuàng)木基丙三醇-8-香草醛醚

睡菜L.為龍膽科睡菜屬多年生水生植物，廣布于北半球溫帶地區(qū)，我國西藏、云南、四川、貴州、黑龍江、吉林、遼寧及鄂西地區(qū)均有分布[1]。又名醉草、綽菜、瞑菜。《本草綱目》記載，睡菜性甘微苦，寒，無毒，以單方入藥，治心膈邪熱，不得眠；《北方常用中草藥手冊(cè)》曰：睡菜味甘微苦，性溫，無毒，能健脾消食、養(yǎng)心安神，治胃炎、胃痛、消化不良、心悸失眠、心神不安[2]。據(jù)《南方草木狀》記載：“睡菜，夏生于池沼間，葉類慈姑，根如藕條，南海人食之，云令人思睡，呼為瞑菜”[3]。睡菜在民間藥食兩用，我國民間部分省市有采集睡菜做泡菜的習(xí)俗，吃后較為嗜睡，可以治療失眠，有養(yǎng)心安神的功效。睡菜中主要含有環(huán)烯醚萜、揮發(fā)油、生物堿、甾體等類成分。

本課題組在前期研究中已證實(shí)睡菜提取物毒性較小且具有良好的鎮(zhèn)靜催眠活性，其中的醋酸乙酯部位具有顯著地鎮(zhèn)靜催眠活性[4]。《問齋醫(yī)案》所云：“動(dòng)甚則怔仲，令人惶惕不安，凄愴不樂，甚至心煩慮亂，不知所從，無故多思，寤不成寐”。闡明了焦慮與失眠有著密切聯(lián)系，并在病因病機(jī)方面有著共通之處。有研究顯示，失眠作為一項(xiàng)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，在焦慮狀態(tài)的發(fā)病過程中起著決定性的作用[5-6]。PC12細(xì)胞株來源于一種可移植的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，分化的PC12細(xì)胞具有典型的神經(jīng)元的功能，被廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞分化、離子通道、受體、遞質(zhì)等研究領(lǐng)域[7]。皮質(zhì)酮是一種糖皮質(zhì)激素，可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的病理損傷，從而誘導(dǎo)焦慮行為。這一特點(diǎn)使得高濃度皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷可模擬焦慮癥神經(jīng)細(xì)胞損傷狀態(tài)[8]。因此本研究從睡菜全草醋酸乙酯部位分離并鑒定得到21個(gè)化合物，并通過建立皮質(zhì)酮損傷的PC12細(xì)胞模型探究睡菜中抗焦慮活性物質(zhì)，該研究結(jié)果為深入開發(fā)利用睡菜植物資源，發(fā)現(xiàn)具有抗焦慮活性的天然活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑

Bruker AV 400型核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；Thermo ISQ LT單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛公司）；Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Waters 1525 EF高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Venusil XBP C18色譜柱（半制備型；250 mm×10 mm，10 μm；分析型：250 mm×4.6 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）；低溫冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）；TECAN infinite F200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；熒光顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司XD30A-RFL）；CO2培養(yǎng)箱（德國binder公司）；低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；MS-TS萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司；正相色譜硅膠（煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所）；反相色譜硅膠（日本YMC公司）；Sephadex LH-20（美國Pharmacia公司）；MCI GEL（日本三菱化學(xué)）；1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；皮質(zhì)酮（美國Medchemexpress公司）；MTT（美國Amersco公司）；DMSO（美國Sigma公司）；高效液相用乙腈、甲醇均為色譜純（美國Tedia公司）；水為三蒸水；其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)用睡菜全草于2018年9月采自湖北省神農(nóng)架大九湖，經(jīng)三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院王玉兵博士鑒定為龍膽科睡菜屬植物睡菜L.的全草。植物標(biāo)本現(xiàn)保存于三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞：PC12高分化細(xì)胞，為三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。接種于含10%胎牛血清，2%谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 提取分離

睡菜干燥全草（6.3 kg）粉碎，用95%乙醇回流提取3次（60 L×3），每次2 h。將乙醇提取液減壓濃縮干燥，得到睡菜醇提總浸膏1514 g，總浸膏加水均勻混懸，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮，得到石油醚萃取部位102 g、醋酸乙酯萃取部位172 g、正丁醇萃取部位350 g。

取醋酸乙酯萃取部位160 g，純水溶解后，AB-8大孔吸附樹脂柱色譜分離，依次用純水及20%、40%、60%、80%、100%乙醇洗脫，減壓濃縮干燥，得到純水洗脫部位（13 g）、20%乙醇水洗脫部位（6 g）、40%乙醇水洗脫部位（34 g）、60%乙醇水洗脫部位（23 g）、60%乙醇水洗脫部位（30 g）、100%乙醇洗脫片段（50 g）。取40%乙醇水洗脫部位，用C18反相硅膠柱色譜分離，水-甲醇梯度洗脫，經(jīng)HPLC分析合并，得到10個(gè)組分Fr. C1～C10。Fr.C3（1500 mg）經(jīng)HW-20F凝膠柱分離，得到Fr. C3a～C3i；Fr. C3a經(jīng)制備型HPLC［乙腈-水（18∶82）］純化，得到化合物7（2.1 mg）、13（9.1 mg）、18（1.1 mg）、21（5.2 mg）；Fr. C3b經(jīng)制備型HPLC［（乙腈-水（20∶80）］純化，得到化合物2（24.4 mg）、5（5.3 mg）；Fr. C3e經(jīng)制備型HPLC［乙腈-水（22∶78）］純化，得到化合物1（3.3 mg）、4（3.2 mg）、14（4.9 mg）、15（3.8 mg）；Fr. C3i經(jīng)制備型HPLC［乙腈-水（23∶77）］純化，得到化合物12（3.1 mg）、16（3.2 mg）、19（2.5 mg）。Fr. C6經(jīng)Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜分離，得到Fr. C6a～C6d。Fr. C6c經(jīng)制備型HPLC［乙腈-水（24∶75）］純化，得到化合物3（11.7 mg）、8（3.1 mg）、9（3.1 mg）、10（8.1 mg）、11（30.1 mg）；Fr. C6d經(jīng)制備型HPLC［乙腈-水（24∶76）］純化，得到化合物6（10.1 mg）、17（3.9 mg）、20（2.3 mg）。

2.2 生物活性評(píng)價(jià)

2.2.1 皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞的濃度選擇 將濃度為1.5×105個(gè)/mL的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為450、550、650、750、850、950、1050、1150μmol/L皮質(zhì)酮溶液，培養(yǎng)48 h后，每孔加入25 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震搖10 min后，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞以1.5×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為對(duì)照組（只加細(xì)胞）、模型組（650 μmol/L皮質(zhì)酮）、實(shí)驗(yàn)組（650 μmol/L皮質(zhì)酮＋200 μmol/L化合物1～21），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.2.3 MTT法檢測(cè)單體化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用 PC12細(xì)胞按照“2.2.1”項(xiàng)方法處理后，每孔加入25 μL MTT（5 mg/mL）繼續(xù)作用4 h后，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震搖10 min后，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA比較分析，并釆用數(shù)據(jù)分析軟件Graphpad Prism 5.03 Turkey’s檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為，＜0.05時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，EI-MS/: 368 [M]+，分子式為C17H20O9。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.51 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7′), 7.06 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2′), 7.02 (1H, dd,= 8.1, 1.9 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.28 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8′), 4.74 (1H, m, H-4), 4.08 (1H, m, H-5), 3.95 (1H, m, H-3), 3.63 (3H, s, -OCH3), 1.81～2.09 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 173.7 (C-7), 166.5 (C-9′), 148.5 (C-4′), 145.6 (C-7′), 144.8 (C-3′), 125.7 (C-1′), 121.3 (C-6′), 115.9 (C-5′), 114.7 (C-2′), 114.5 (C-8′), 75.6 (C-4), 73.5 (C-1), 65.4 (C-5), 64.5 (C-3), 51.7 (-OCH3), 40.9 (C-2), 38.1 (C-6) 。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定化合物1為4--咖啡酰奎尼酸甲酯。

化合物2：白色粉末，EI-MS/:368 [M]+，分子式為C17H20O9。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.51 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7′), 7.05 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2′), 6.95 (1H, dd,= 8.1, 1.9 Hz, H-6′), 6.79 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.20 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8′), 5.26 (1H, m, H-3), 4.13 (1H, m, H-5), 3.72 (1H, dd,= 7.5, 3.1 Hz, H-4), 3.69 (3H, s, -OCH3), 2.00～2.23 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 175.5 (C-7), 168.3 (C-9′), 149.6 (C-4′), 147.4 (C-7), 146.6 (C-3′), 127.5 (C-1′), 123.1 (C-6′), 116.2 (C-5′), 115.2 (C-2′), 115.0 (C-8′), 75.7 (C-1), 72.3 (C-4), 72.1 (C-3), 70.1 (C-5), 53.0 (-OCH3), 38.1 (C-6), 37.6 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故鑒定化合物2為綠原酸甲酯。

化合物3：白色粉末，EI-MS/:354 [M]+，分子式為C18H18O9。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.58 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7′), 7.02 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.95 (1H, dd,= 8.1, 2.0 Hz, H-6′), 6.76 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.32 (1H, t,= 15.9 Hz), 5.35 (1H, m, H-3), 4.15 (1H, m, H-5), 3.65 (1H, dd,= 8.5, 3.4 Hz, H-4), 1.96～2.22 (4H, m, H-2, 6)；13C- NMR (100 MHz, CD3OD): 178.3 (C-7), 169.1 (C-9′), 149.5 (C-4′), 146.6 (C-7′), 146.6 (C-3′), 127.8 (C-1′), 122.8 (C-6′), 116.5 (C-5′), 115.9 (C-8′), 115.1 (C-2′), 75.5 (C-1), 74.8 (C-4), 73.1 (C-3), 68.3 (C-5), 41.6 (C-6), 36.6 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故鑒定化合物3為綠原酸。

化合物4：白色粉末，EI-MS/: 220 [M]+，分子式為C11H10O5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.89 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 6.77 (1H, s, H-5), 6.32 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3), 3.81 (3H, s, 6-OCH3), 3.77 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 160.3 (C-2), 149.9 (C-6), 144.9 (C-4), 140.3 (C-7), 138.5 (C-9), 138.4 (C-8), 114.6 (C-3), 114.5 (C-10), 100.4 (C-5), 60.7 (7-OCH3), 56.1 (6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定化合物4為異秦皮素。

化合物5：白色粉末，EI-MS/:222 [M]+，分子式為C11H10O5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.83 (1H, d,= 9.5 Hz, H-4), 6.91 (1H, s, H-5), 6.20 (1H, d,= 9.5 Hz, H-3), 3.94 (3H, s, 6-OCH3), 3.88 (3H, s, 8-OCH3)?13C-NMR (400 MHz, CD3OD): 163.4 (C-2), 147.8 (C-8), 146.6 (C-4), 146.3 (C-9), 144.8 (C-7), 136.7 (C-8), 112.2 (C-3), 112.1 (C-10), 104.9 (C-5), 61.7 (8-OCH3), 56.7 (6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定化合物5為異嗪皮啶。

化合物6：白色無定形粉末，EI-MS/:538 [M]+，分子式為C26H34O12。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.14 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 7.12 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 7.02 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2′), 6.97 (1H, dd,= 8.2, 1.9 Hz, H-6), 6.87 (1H, dd,= 8.1, 1.7 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 4.98 (1H, d,= 8.1 Hz, H-7′), 4.93 (1H, d,= 8.4 Hz, H-7), 4.89 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1′′), 3.89 (3H, s, 3-OCH3), 3.88 (3H, s, 3′-OCH3), 3.56～3.73 (4H, m, H-9, 9′), 2.32 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 151.1 (C-3), 149.2 (C-3′), 147.6 (C-4), 147.4 (C-4′), 138.8 (C-1), 134.7 (C-1′), 120.5 (C-6), 120.3 (C-6′), 118.1 (C-5), 116.2 (C-5′), 111.7 (C-2), 111.2 (C-2′), 103.0 (C-1′′), 84.9 (C-7′), 84.2 (C-7), 78.2 (C-5′′), 77.9 (C-3′′), 74.4 (C-2′′), 71.4 (C-4′′), 62.6 (C-2′′), 61.9 (C-9), 61.7 (C-9′), 56.8 (3-OCH3), 56.5 (3′-OCH3), 55.4 (C-8′), 55.2 (C-8)；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物6為7,7′,8,8′-(+)-新-橄欖脂素-4--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物7：白色無定形粉末，EI-MS/:552 [M]+，分子式為C27H36O12。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.77 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′), 6.71 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.66 (2H, s, H-2, 6), 6.61 (1H, dd,= 8.0, 1.8 Hz, H-6′), 4.86 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1′′), 4.75 (1H, d,= 7.0 Hz, H-7), 3.99 (1H, m, H-9′a), 3.88 (1H, m, H-9a), 3.84 (6H, s, 3, 5-OCH3), 3.82 (3H, s, 3′-OCH3), 3.71 (1H, m, H-9′b), 3.58 (1H, d,= 7.5 Hz, H-7′), 2.88 (1H, dd,= 13.4, 5.1 Hz, H-7′a), 2.67 (1H, m, H-8′), 2.48 (1H, dd,= 13.4, 2.4 Hz, H-7′b), 2.32 (1H, m, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 154.3 (C-3, 5), 147.5 (C-3′), 144.6 (C-4′), 141.4 (C-4), 135.4 (C-1), 133.6 (C-1′), 122.2 (C-6′), 116.4 (C-5′), 113.2 (C-2′), 105.1 (C-1′′), 104.5 (C-2, 6), 83.9 (C-7), 78.2 (C-5′′), 77.7 (C-3′′), 75.6 (C-2′′), 73.8 (C-9′), 71.2 (C-4′′), 62.6 (C-6′′), 60.8 (C-9), 57.1 (3, 5-OCH3), 56.2 (3′-OCH3), 54.2 (C-8), 43.8 (C-8′), 33.5 (C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物7為腫柄雪蓮苷。

化合物8：白色無定形粉末，EI-MS/: 418 [M]+，分子式為C22H26O8。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.60 (4H, s, H-2, 2′, 6, 6′), 4.72 (2H, d,= 3.9 Hz, H-7, 7′), 4.29 (2H, dd,= 8.9, 6.4 Hz, H-9a, 9a′), 3.88 (12H, s, 4×OCH3), 3.86～3.92 (2H, m, H-9b, 9b′), 3.10 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 147.2 (C-3, 3′, 5, 5′), 134.5 (C-4, 4′), 132.3 (C-1, 1′), 102.6 (C-2, 2′, 6, 6′), 86.4 (C-7, 7′), 71.8 (C-9, 9′), 56.5 (4×OCH3), 54.6 (C-8, 8′)?以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物8為丁香脂素。

化合物9：白色無定形粉末，EI-MS/:348 [M]+，分子式為C18H20O7。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 9.80 (1H, s, H-7′), 7.46 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6′), 7.35 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2′), 7.23 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5′), 7.01 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.80 (1H, dd,= 8.1, 1.9 Hz, H-6), 6.67 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 4.71 (1H, d,= 5.6 Hz, H-7), 4.65～4.51 (1H, m, H-8), 3.80 (3H, s, 3′-OCH3), 3.73 (3H, s, 3-COH3), 3.65 (1H, dd,= 11.9, 5.9 Hz, H-9a), 3.51 (1H, dd,= 11.9, 3.4 Hz, H-9b)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 191.2 (C-7′), 154.1 (C-4′), 149.6 (C-4), 147.0 (C-3′), 145.5 (C-3), 132.8 (C-1), 129.2 (C-1′), 125.6 (C-6′), 119.2 (C-6), 114.5 (C-5′), 113.7 (C-5), 111.1 (C-2), 110.3 (C-2′), 83.5 (C-8), 71.4 (C-7), 60.3 (C-9), 56.1 (3′-OCH3), 55.9 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物9為蘇式-(7,8)-愈創(chuàng)木基丙三醇-8-香草醛醚。

化合物10：白色無定形粉末，EI-MS/:522 [M]+，分子式為C26H34O11。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.13 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 7.01 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd,= 8.4, 1.7 Hz, H-6), 6.73 (1H, d,= 1.7 Hz, H-6′), 6.71 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2′), 5.53 (1H, d,= 5.8 Hz, H-7), 4.89 (1H, d,= 7.3 Hz, Glc-H-1′′), 3.83 (3H, s, 3-OCH3), 3.82 (3H, s, 3′-OCH3), 3.75 (1H, m, H-9a), 3.66 (1H, m, H-9b), 3.54 (2H, t,= 6.5 Hz, H-9′), 3.45 (1H, m, H-8), 2.62 (2H, t,= 7.5 Hz, H-7′), 1.81 (2H, m, H-8′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 149.4 (C-3), 146.3 (C-4), 146.1 (C-4′), 143.7 (C-3′), 137.1 (C-1), 135.6 (C-1′), 128.3 (C-5′), 118.0 (C-6), 116.8 (C-5), 116.5 (C-6′), 112.7 (C-2′), 109.7 (C-2), 101.3 (C-1′′), 87.2 (C-7), 76.9 (C-5′′), 76.4 (C-3′′), 73.4 (C-2′′), 70.1 (C-4′′), 63.6 (C-9), 61.2 (C-6′′), 60.7 (C-9′), 55.5 (3-OCH3), 55.2 (3′-OCH3), 54.3 (C-8), 34.5 (C-8′), 31.5 (C-7′)?以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物10為 (7,8)-二氫去氫二松柏醇-4--β--吡喃葡萄糖苷?

化合物11：白色粉末，EI-MS/522 [M]+，分子式為C26H34O11?1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.01 (1H, d,= 9.0 Hz, H-5′), 6.89 (1H, brs, H-2), 6.76 (1H, d,= 1.9 Hz, H-6′), 6.75 (1H, s, H-6), 6.65 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.55 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 4.85 (1H, d,= 7.0 Hz, Glc-H-1′′), 4.73 (1H, d,= 6.0 Hz, H-7′), 3.89 (1H, m, 6.0 Hz, H-9′), 3.73 (6H, s, 2×OCH3), 3.45 (2H, m, H-9), 2.21 (1H, m, H-8′), 3.66 (1H, m, H-8′), 3.59 (1H, t,= 7.4 Hz, H-9′), 2.82 (1H, m, H-7′), 2.56 (1H, m, H-8), 2.40 (1H, m, H-7′), 2.20 (1H, m, H-8′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 148.6 (C-3′), 147.5 (C-3), 145.4 (C-4′), 144.5 (C-4), 137.1 (C-1′), 131.7 (C-1), 120.7 (C-6), 117.6 (C-6′), 115.4 (C-5), 115.4 (C-5′), 112.6 (C-2′), 112.6 (C-2), 100.2 (C-1′′), 81.6 (C-7′), 77.0 (C-5′′), 71.8 (C-2′′), 71.8 (C-9), 69.7 (C-4′′), 60.4 (C-6′′), 58.4 (C-9′), 56.2 (-OCH3), 55.3 (-OCH3), 52.6 (C-8′), 41.8 (C-8), 32.2 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物11為(?)-落葉松脂素- 4--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物12：黃色粉末，EI-MS/594 [M]+，分子式為C27H30O15。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.99 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2′, 6′), 6.86 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3′, 5′), 6.35 (1H, s, H-8), 6.16 (1H, s, H-6), 5.29 (1H, d,= 8.0 Hz, Glc-H-1′′), 4.40 (1H, brs, Rha-H-1′′′), 1.00 (3H, d,= 7.5 Hz, Rha-H-6′′′)；13C- NMR (100 MHz, DMSO-6): 177.3 (C-4), 165.4 (C-7), 161.2 (C-5), 160.1 (C-4), 156.5 (C-2), 133.3 (C-3), 131.0 (C-2′, 6′), 120.8 (C-1), 115.2 (C-3′, 5′), 103.4 (C-10), 101.5 (C-1′′), 100.7 (C-1′′′), 99.0 (C-6), 93.8 (C-8), 76.3 (C-3′′), 75.9 (C-5′′), 74.1 (C-2′′), 71.9 (C-4′′′), 70.5 (C-4′′), 70.4 (C-2′′′), 69.8 (C-3′′′), 68.2 (C-5′′′), 67.0 (C-6′′), 17.7 (C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，故鑒定化合物12為山柰酚-3--蕓香糖苷。

化合物13：黃色粉末，EI-MS/: 624 [M]+，分子式為C28H32O16。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.87 (1H, s, H-2′), 7.53 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6′), 6.93 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.41 (1H, s, H-8), 6.20 (1H, s, H-6), 5.45 (1H, d,= 7.2 Hz, Glc-H-1′′), 4.44 (1H, brs, Rha-H-1′′′), 3.27 (3H, s, -OCH3), 0.99 (3H, d,= 6.2 Hz, Rha-H-6′′′), 0.99 (3H, d,= 6.1 Hz, Rha-H-6′′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 177.3 (C-4), 164.5 (C-7), 161.2 (C-5), 157.1 (C-2), 156.1 (C-9), 149.1 (C-4′), 147.5 (C-3′), 133.1 (C-3), 122.4 (C-6′), 121.2 (C-1′), 115.4 (C-5′), 113.4 (C-2′), 103.4 (C-10), 102.2 (C-1′′), 101.0 (C-1′′′), 99.6 (C-6), 94.4 (C-8), 76.7 (C-3′′), 76.1 (C-5′′), 74.5 (C-2′′), 72.1 (C-4′′′), 70.9 (C-2′′′), 70.7 (C-4′′), 70.3 (C-3′′′), 68.5 (C-5′′′), 67.2 (C-6′′), 56.0 (-OCH3), 18.0 (C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，故鑒定化合物13為槲皮素-3--蕓香糖苷。

化合物14：黃色粉末，EI-MS/: 222 [M]+，分子式為C13H18O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.01 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7), 6.46 (1H, d,= 15.8 Hz, H-8), 5.97 (1H, m, H-4), 2.65 (1H, d,= 17.8 Hz, H-2), 2.32 (3H, s, H-10), 1.91 (3H, d,= 1.4 Hz, H-13), 1.07 (3H, s, H-12), 1.01 (3H, s, H-11)；13C- NMR (100 MHz, CD3OD): 199.2 (C-9), 199.0 (C-3), 163.1 (C-5), 147.0 (C-7), 130.4 (C-8), 126.5 (C-4), 78.4 (C-6), 49.2 (C-2), 41.7 (C-1), 26.3 (C-10), 23.4 (C-12), 22.1 (C-11), 17.5 (C-13)?以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物14為去氫吐葉醇。

化合物15：無色油狀物，EI-MS/: 224 [M]+，分子式為C13H20O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 5.70 (1H, d,= 15.5 Hz, H-7), 5.63 (1H, d,= 15.5 Hz, H-8), 5.78 (1H, brs, H-4), 4.19 (1H, d,= 6.4 Hz, H-9), 2.35 (1H, d,= 16.6 Hz, H-2a), 2.05 (1H, d,= 16.6 Hz, H-2b), 1.82 (3H, d,= 1.2 Hz, H-13), 1.11 (3H, s, H-10), 0.93 (3H, s, H-11), 0.91 (3H, s, H-12)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 197.5 (C-3), 164.5 (C-5), 135.8 (C-7), 127.9 (C-8), 125.5 (C-4), 77.9 (C-6), 65.9 (C-9), 49.4 (C-2), 41.0 (C-1), 24.1 (C-10), 23.7 (C-12), 23.1 (C-11), 19.0 (C-13)?以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故鑒定化合物為布盧門醇A。

化合物16：白色無定形粉末，EI-MS/:196 [M]+，分子式為C11H16O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.73 (1H, s, H-7), 4.18 (1H, m, H-3), 2.42 (1H, dt,= 14.0, 2.8 Hz, H-4b), 2.01 (1H, dt,= 14.5, 2.8 Hz, H-2b), 1.77 (3H, s, H-11), 1.75 (1H, dd,= 14.0, 3.8 Hz, H-4a), 1.51 (1H, dd,= 14.5, 3.8 Hz, H-2a), 1.47 (3H, s, H-9), 1.27 (3H, s, H-10)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 185.4 (C-6), 174.4 (C-8), 113.2 (C-7), 88.8 (C-5), 67.2 (C-3), 47.7 (C-2), 46.3 (C-4), 37.2 (C-1), 30.7 (C-10), 27.1 (C-11), 26.6 (C-9)?以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，故鑒定化合物16為黑麥草內(nèi)酯。

化合物17：黃色油狀物，EI-MS/:196 [M]+，分子式為C12H20O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.75 (1H, dd,= 7.1, 1.3 Hz, H-3), 5.88 (1H, dd,= 17.2, 10.7 Hz, H-7), 5.21 (1H, dd,= 17.2, 1.4 Hz, H-8a), 5.08 (1H, dd,= 10.7, 1.4 Hz, H-8b), 3.71 (3H, s, -OCH3), 2.19 (2H, m, H-4), 1.81 (3H, s, H-10), 1.62 (2H, m, H-5), 1.28 (3H, s, H-9)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 168.7 (C-1), 144.4 (C-7), 142.1 (C-3), 127.6 (C-2), 112.2 (C-8), 73.1 (C-6), 51.7 (-OCH3), 40.7 (C-5), 27.9 (C-9), 23.5 (C-4), 12.2 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，故鑒定化合物17為()-6-羥基-2, 6-二甲基辛-2,7-二烯酸甲酯。

化合物18：白色無定形粉末，EI-MS/:432 [M]+，分子式為C19H28O11。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.15 (1H, d,= 6.5 Hz, H-6), 7.03 (1H, d,= 2.9 Hz, H-2), 6.95～7.02 (2H, m, H-4, 5), 4.86 (1H, d,= 6.6 Hz, Glc-H-1′), 4.72 (1H, d,= 1.2 Hz, Rha-H-1′′), 3.86 (3H, s, 3-OCH3), 1.21 (3H, d,= 5.2 Hz, Rha-H-6′′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 150.7 (C-3), 147.8 (C-1), 124.3 (C-2), 122.2 (C-5), 118.5 (C-6), 113.5 (C-4), 102.5 (C-1′), 102.2 (C-1′′), 77.9 (C-3′), 76.8 (C-5′), 75.0 (C-2′), 74.1 (C-3′′), 72.3 (C-4′′), 72.2 (C-2′′), 71.5 (C-4′), 70.1 (C-5′′), 67.9 (C-6′), 56.8 (-OCH3), 17.9 (C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25]，故鑒定化合物18為3-甲氧基苯酚-1--α--吡喃鼠李糖基-(1→6)--β--吡喃葡萄糖苷。

化合物19：淺黃色粉末，EI-MS/:134 [M]+，分子式為C7H6N2O。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 10.71 (2H, s, 2×NH), 7.04～6.97 (4H, m, H-5, 6, 7, 8)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 155.3 (C-2), 129.7 (C-4, 9), 120.4 (C-6, 7), 108.5 (C-5, 8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]，故鑒定化合物19為2-羥基苯并咪唑。

化合物20：無色針狀晶體（氯仿），EI-MS/: 182 [M]+，分子式為C9H10O4。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.79 (1H, s, 1-CHO), 7.13 (2H, s, H-2, 6), 3.91 (6H, s, 3, 5-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 190.5 (C-1), 147.1 (C-3, 5), 141.0 (C-4), 128.2 (C-1), 106.8 (C-6), 56.3 (3, 5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27]，故鑒定化合物20為syringaldehyde。

化合物21：無色粉末，EI-MS：/138 [M]+，分子式為C8H10O2。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.25～7.38 (5H, m, H-2～6), 4.67 (1H, dd,= 7.4, 4.7 Hz, H-1′), 3.64 (2H, m, H-2′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 143.4 (C-1), 129.1 (C-3, 5), 128.4 (C-4), 127.5 (C-2, 6), 76.1 (C-1′), 68.5 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[28]，故鑒定化合物21為1-苯基- 1,2-乙二醇。

3.2 皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞損傷的濃度選擇

結(jié)果（圖1）顯示，皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞的損傷程度隨濃度呈相關(guān)性上升，450、550、650、750、850、950、1050、1150 μmol/L皮質(zhì)酮作用PC12細(xì)胞48 h后，其細(xì)胞存活率分別為（88.81±2.21）%、（77.07±4.21）%、（52.47±0.99）%、（44.78±0.95）%、（34.26±0.91）%、（26.96±3.36）%、（12.32±0.22）%、（13.21±2.02）%。本結(jié)果驗(yàn)證了一定濃度的皮質(zhì)酮確實(shí)能損傷神經(jīng)元，650 μmol/L皮質(zhì)酮作用48 h對(duì)高分化PC12細(xì)胞的抑制率接近50%，故選擇以體外650 μmol/L皮質(zhì)酮48 h作用于PC12細(xì)胞以模擬焦慮癥神經(jīng)細(xì)胞損傷狀態(tài)，構(gòu)建抗焦慮活性成分體外細(xì)胞篩選模型。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01

3.3 單體化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

結(jié)果顯示，與模型組相比，化合物1～5、7、9～11、15～17與650 μmol/L皮質(zhì)酮共同作用PC12細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率分別提高至（92.29±2.31）%、（90.74±1.61）%、（91.62±1.83）%、（63.11±2.30）%、（61.01±1.21）%、（101.18±1.56）%、（105.23±1.11）%、（67.77±1.89）%、（65.66±1.06）%、（75.94±0.24）%、（64.39±1.47）%、（72.88±1.82）%。苯丙素、木脂素、黃酮、單萜類均有不同程度的促進(jìn)皮質(zhì)酮（650 μmol/L）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增殖的作用。其中，化合物1～3、7、9對(duì)皮質(zhì)酮（650 μmol/L）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用最為顯著，見圖2。

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

本研究從睡菜全草醋酸乙酯部位分離并鑒定得到21個(gè)化合物，包括3個(gè)苯丙素類（1～3），2個(gè)香豆素類（4和5），6個(gè)木脂素類（6～11），2個(gè)黃酮類（12和13），4個(gè)單萜類（14～17），4個(gè)其他類（18～21）。同時(shí)考察了21個(gè)化合物對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明化合物1～3、7、9表現(xiàn)出顯著的保護(hù)作用，化合物4、5、10、11、15～17表現(xiàn)出中等的保護(hù)作用。

北五味子作為我國傳統(tǒng)的安神藥，近年來的研究報(bào)道了北五味子木脂素具有顯著的中樞抑制與安神作用[29]。合歡皮經(jīng)研究也證明其抗焦慮的主要活性成分是(?)-丁香樹脂酚-4--β--葡萄糖苷，其作用機(jī)制可能與抑制PC12細(xì)胞線粒體凋亡有關(guān)[30]。后續(xù)將進(jìn)一步探索睡菜主要活性成分對(duì)皮質(zhì)酮損傷的PC12細(xì)胞的抗凋亡及保護(hù)作用機(jī)制，闡明睡菜抗焦慮活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents of ethyl acetate extract fromand their neuroprotective activity

JIN Guan1, HE Zhi-yun1, ZHANG Zhi-qi2, LIU Cheng-xiong1, CHEN Jian-feng1, ZOU Kun1, CHENG Fan1

1. Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Biological and Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China 2. Shengnongjia National Park Administration, Shengnongjia Forestry District 442400, China

To study the chemical constituents of the ethyl acetate extract from the whole herb ofof Gentianaceae.various chromatographic techniques, including positive phase silica gel column chromatography, thin-layer chromatography, AB-8 macroporous resin column chromatography, Sephadex LH-20 and preparative HPLC were used to separate and purify the chemical constituents.cell model was used for preliminary confirmation of the neuroprotective ability of compounds on corticosterone (CORT)-induced neurotoxicity in differentiated PC12 cells.Their structures were determined by various spectral data. Finally, 21 compounds were isolated from the acetic ether extract ofand the structures were identified as 4--caffeoylquinic acid methyl ester (1), methylchlorogenate (2), chlorogenic acid (3), isofraxetin (4), isofraxidin (5), 7,7′,8,8′-(+)-neo-olivil-4--β--glucopyranoside (6), conicaoside (7), (?)-syringaresinol (8),-(7,8)-guaiacylglycerol 8-vanillin ether (9), (7,8)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4--β--glucopyranoside (10), (?)-lariciresinol-4--β-- glucoyranoside (11), kaempferol-3--rutinoside (12), quercetin-3--rutinoside (13), dehydrovomifoliol (14), blumenol A (15), loliolide (16), ()-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoicacidmethylester (17), 3-methoxyphenol 1--α--rhamnopyranosyl- (1→6)--β--glucopyranoside (18), 2-hydroxybenzimidazole (19), syringaldehyde (20), 1-phenyl-1,2-ethanediol (21). The neuroprotective effects investigation of compounds on CORT-induced neurotoxicity in differentiated PC12 cells showed that compounds 1—3, 7, 9 had significant protective effects on PC12 cells, and compounds 4, 5, 10, 11, 15—17 showed moderate protective effects.Compounds 1—9, 11—12, 14—21 are isolated fromfor the first time. Some compounds exert neuroprotective activity to corticosterone-induced injury of PC12 cells.

L.; anxiolytic activity; PC12 cell; neuroprotective activity; 4--caffeoylquinic acid methyl ester; chlorogenic acid; isofraxetin;-(7,8)-guaiacylglycerol 8-vanillin ether

R284.1

A

0253 - 2670(2022)04 - 0985 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.004

2021-10-19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773952）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803383）；湖北省神農(nóng)架林區(qū)自然科學(xué)基金（SNJKJ2016029）

金 冠（1996—），碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail: 1026102943@qq.com

程 凡（1973—），副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail: chengf@ctgu.edu.cn

#共同第一作者：何芷蕓（1997—），碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail: 373389451@qq.com

[責(zé)任編輯 王文倩]