外泌體在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩治療中的研究進展

陶瑞 譚植襄 李思成 張偉 阮晶晶 余墨聲 朱占永

瘢痕是皮膚創傷愈合后形成的終末產物[1]。瘢痕的適當形成在人體自我修復方面具有積極作用，但修復過程中有序的平衡被打破時，創面可能異常愈合產生瘢痕疙瘩或增生性瘢痕[2]。前者生長不受限制，瘢痕可向周圍擴展，后者瘢痕范圍一般不超過組織損傷范圍，但二者都以成纖維細胞異常增殖、細胞外基質大量沉積為主要特征[3]。在發達國家，每年約有1億人為瘢痕及其相關問題所困擾[4]。瘢痕的出現不僅影響美觀、帶來局部不適，還能造成局部攣縮或畸形，影響患肢正常運動[5]。目前，瘢痕常規治療方式包括手術、放療、藥物治療，新型療法有電刺激、干細胞療法等[6]。由于瘢痕的高復發率以及缺少有效評估治療方法的深入研究，瘢痕治療依舊沒有被廣泛認可的特效方法，尋找新的治療方案頗具意義[7]。有研究表明，外泌體可對瘢痕產生影響，能應用于增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的治療[8]。

一、外泌體概述

外泌體是一類直徑在30～150 nm之間，主要由胞內溶酶體微粒內陷形成的具有雙層膜樣結構的多囊泡體[9]。研究發現，外泌體中包含核酸、脂類、蛋白質等多種生物活性物質[10]。最初的研究認為,外泌體的產生及分泌是細胞處理胞內多余物質的方法之一，有實驗證明，外泌體可實現物質的胞間轉運，在胞間通訊過程中發揮重要作用[11]。此外，外泌體還具有免疫原性低、無細胞毒性、分子量低、安全性高等優勢，能保證運載物質不被過早降解從而喪失活性[12]。

二、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的形成機制

增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的病理學特征是細胞和細胞外基質的過度堆集。而與之形成相關的因素大致可分為三類：遺傳因素、機械張力、全身性因素[13]。

1.遺傳因素：通過研究瘢痕疙瘩病人家系，有學者認為它是不完全外顯的常染色體顯性遺傳，且具有遺傳異質性和延遲顯性的特征[14]。在瘢痕疙瘩與增生性瘢痕易感基因位點和基因多態性的研究上，Nakashima等[15]使用全基因組關聯研究方法發現，瘢痕疙瘩與3個染色體區域中的4個單核苷酸多態性(SNP)位點顯著相關。增生性瘢痕中也有類似報道，其與3個基因中的3個SNP存在相關性[16]。除了基因本身，表觀遺傳機制也在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的發生發展中起到重要作用。Hsus等[17]發現，使用曲古菌素(TSA)處理瘢痕中成纖維細胞可增加組蛋白H3的乙酰化水平，提高窖蛋白(CAV1)表達，減少Runt相關轉錄因子2(RUNX2)和纖維黏連蛋白的產生，從而降低成纖維細胞自身的遷移能力，抑制纖維化的發生。ncRNAs作用方面，lncRNA CACNA1-AS1可通過抑制miRNA-205表達，促進人瘢痕成纖維細胞的增殖和侵襲，抑制其凋亡[18]； cricRNA COL5A1可發揮內源競爭RNA的功能，通過吸附miRNA-7-5p釋放環磷酸腺苷交換蛋白1(Epac1)，激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路，促進瘢痕異常增生[19]。

2.局部機械張力：臨床實踐過程中，人們發現增生性瘢痕、瘢痕疙瘩好發于前胸、肩胛等部位。這些部位皮膚常受到牽拉刺激，具有較高機械張力[20]。臨床經驗證實，降低皮膚所受機械張力，可顯著降低增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的發生率[21]。上述證據表明機械張力與瘢痕的發生發展關系密切。深入研究發現，皮膚局部機械張力可通過黏附斑激酶(FAK)/ 胞外相關激酶(ERK)/ 單核細胞趨化蛋白1(MCP1)途徑加速傷口愈合纖維化，促進瘢痕產生[22]。Gao等[23]研究發現，瘢痕組織中富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG-1)存在過表達現象，而LRG-1的表達與機械負荷呈現出時間和強度依賴關系。在機械張力導致的增生性瘢痕小鼠模型中，利用shRNA降低LRG-1的表達可減少新生血管的生成，抑制瘢痕形成。機械負荷誘導LRG-1的關鍵在于FAK / ERK信號通路的激活。這些研究發現，從微觀角度進一步強調了機械張力與瘢痕的關聯。

3.全身性因素：影響增生性瘢痕、瘢痕疙瘩形成的主要全身性因素是循環免疫系統和內分泌系統產生的相關生物因子或蛋白[24]。有研究發現，常見的細胞因子及蛋白中，TGF-β1/2、IL-6/8/17/18、PDGF、FGF、EGF等具有促進瘢痕形成的作用，而TGF-β3、IL-4/10、基質金屬蛋白酶2/9(MMP-2/9)的作用則正好相反。這些生物活性物質直接參與瘢痕的血管形成、炎癥反應、組織纖維化和重塑等過程[25]。除此以外，個人生活習慣也對瘢痕有一定影響。Deliaert等[26]在一項前瞻性臨床研究中發現，吸煙者手術切口處瘢痕嚴重程度比不吸煙者更輕。產生該現象的原因可能是：吸煙會減少全身炎癥反應。香煙中的尼古丁作為一種血管收縮劑，也可抑制巨噬細胞和成纖維細胞的增殖和遷移，減少膠原蛋白沉積[27]。Hochman等[28]研究認為，應激事件觸發影響心理狀態的同時也能加重瘢痕的癥狀和體征，其機制可能是心理應激刺激神經、免疫及內分泌系統，在創面上則表現出神經性炎癥的增強。這些研究暗示影響瘢痕產生的相關危險因素及其實際作用效應遠比我們想象的要復雜許多。

三、外泌體與瘢痕

1.外泌體對炎癥反應的調控：適度且可控的炎癥反應有利于創面組織正常修復，減少瘢痕產生[29]。與正常瘢痕組織相比，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中炎癥細胞明顯增多。此外，促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達也顯著上調。這些均提示異常的炎癥反應是瘢痕增生的決定性因素之一。瘢痕的大小、生長速度與炎癥反應的刺激強度、持續時間具有相關性[30]。故對異常炎癥反應的調控是治療增生性瘢痕、瘢痕疙瘩的重要途徑之一。

外泌體主要抗炎機制之一是其能夠作用于炎癥細胞，使其表型轉化為抗炎或免疫抑制細胞。如骨髓基質細胞來源外泌體就可誘導巨噬細胞由M1型向M2型極化，調節促、抗炎因子表達比例，最終通過減輕局部炎癥反應加速組織修復，減少瘢痕形成[31]。外泌體能影響巨噬細胞極化是因為其對信號通路的影響。脂肪干細胞(ADSC)來源外泌體可通過介導核因子E2相關因子2(Nrf2)/ 血紅素加氧酶1(HO-1)軸實現對巨噬細胞的調節并減輕氧化應激[32]。過表達Nrf2的ADSC來源外泌體可以抑制ROS和炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的表達，進一步佐證以上觀點[33]。褪黑素刺激下間充質干細胞(MSC)來源外泌體則可通過靶向PTEN/AKT信號通路，促使巨噬細胞向M2極化[34]。此外，外泌體也可以直接作用于抗炎細胞，達到減輕炎癥的目的。骨髓MSC來源外泌體就可直接上調IL-10、TGF-β1的表達，促進調節性T細胞增殖，加強免疫抑制[35]。

2.外泌體對血管生成的調控：增生性瘢痕、瘢痕疙瘩比生理性瘢痕血管密度更高，深部組織供血更豐富[36]。有研究發現，這些瘢痕組織中新生血管的內皮細胞是紊亂的，并對其發病機制提出新的觀點：瘢痕疙瘩、增生性瘢痕是血管性疾病，內皮功能障礙在其發病過程中起關鍵作用。具體表現為：各類致病因素在創面愈合炎癥階段誘導了增生血管的內皮細胞功能障礙，提高了血管通透性，導致炎癥細胞發生趨化、聚集，產生的炎性因子通過損傷血管進入血管周圍區域，加劇局部炎癥反應，進而促進瘢痕發展[37]。故減少新生血管的產生可降低瘢痕組織沉積。

有證據表明，外泌體中ncRNAs是抑制血管生成的主要物質之一。膠質瘤干細胞來源外泌體中miR-994可通過抑制AKT / ERK信號通路和VEGF的表達來抑制血管生成[38]。壓力負荷誘導的脊索細胞來源外泌體通過調控miR-140-5p/Wnt/β-Catenin軸抑制血管生成[39]。

3.外泌體對細胞外基質與成纖維細胞的調控：正常傷口愈合增殖階段，成纖維細胞部分分化為肌成纖維細胞，通過表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)收縮傷口。隨后肌成纖維細胞在傷口愈合重塑階段發生凋亡，傷口愈合部位形成生理性瘢痕。而在異常的愈合進程中，肌成纖維細胞持續存在，造成創面組織過度收縮，并在局部產生了過量的以膠原蛋白為主的細胞外基質，最終形成增生性瘢痕、瘢痕疙瘩[40]。

人脂肪干細胞來源外泌體(ASC-Exo)可以抑制瘢痕組織中成纖維細胞的增殖、遷移、膠原合成，減輕其對創面的收縮作用[41]。進一步實驗發現，創面部位注射ASC-Exos 可以增加Ⅲ型膠原與Ⅰ型膠原的比例，減少瘢痕形成面積，同時增加體內TGF-β3與TGF-β1的比例，阻止成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。此外，ASC-Exos 通過激活ERK / MAPK途徑增加了皮膚真皮成纖維細胞MMP3的表達，使得MMP3與組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)的比例升高，這更利于細胞外基質的重塑[42]。臍帶來源的MSC外泌體可通過抑制TGF-β / Smad2信號通路阻礙成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，減輕瘢痕形成[43]。

4.外泌體對細胞凋亡的調控：在大面積燒傷或機械性創傷組織中，成纖維細胞往往過度增殖、分化而不易發生凋亡[44]。因此，誘導成纖維細胞凋亡可能是繼抑制成纖維細胞增殖之后又一新的潛在治療手段。在瘢痕組織中，目前發現與細胞凋亡相關的基因包括p53基因、Survivin基因、Bcl-2基因等[45]。

骨髓來源MSC可分泌含有miR-9-5p的外泌體[46]，而miR-9-5p不僅可以抑制增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中成纖維細胞細胞外基質相關基因(如α-SMA，vimentin，col1a) 的表達，防止細胞外基質的過多沉積，還可以通過靶向抑制過氧化物酶體增殖物激活受體 β(PPAR β)的表達，加速成纖維細胞凋亡[47]。此外，Pang等[48]研究發現，miR-152-5p可通過調節Smad3的表達，促進瘢痕組織中成纖維細胞的凋亡。Zhou等[49]實驗提示，miR-519d可直接作用于靶基因Sirtuin(SIRT7) 的3′UTR，抑制增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中成纖維細胞 α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達，誘導其凋亡。

四、總結與展望

綜上所述，外泌體可對增生性瘢痕和瘢痕疙瘩發揮多種作用。大量研究表明，外泌體具有減輕炎癥反應、調控血管形成、重塑細胞外基質、抑制成纖維細胞增殖和分化、誘導成纖維細胞凋亡等特性，并可通過這些機制抑制瘢痕形成或治療瘢痕。然而不同條件下不同細胞來源的外泌體，其所含成分差異巨大。同時，想要明確某一外泌體中包含物質的所有準確成分，其難度與工作量不容小覷。故針對外泌體有效治療瘢痕的詳細作用機制仍待探索。

此外，雖然外泌體對瘢痕有治療效果，并且還具有免疫原性低、生物活性高、體外儲存方便等優勢，但其體內半衰期短、清除速率快、大規模制備困難、制備成本較高等缺點不可忽視。目前已有可運載外泌體的生物活性載體或支架來解決上述部分問題，但這類產品的開發尚不完全成熟，材料的選擇、制備工藝的優化以及生物相容性等問題將是需要不斷鉆研的長期課題。

外泌體目前有望成為臨床治療瘢痕的一種新型手段，在抑制瘢痕形成、減少瘢痕面積、改善瘢痕臨床結局方面發揮積極作用。未來，外泌體很可能被商品化而大規模應用于實際臨床診療中，通過單用或與已有療法聯用切實幫助瘢痕病人減輕痛苦，提高生活質量。