西部煤礦區深色有隔內生真菌修復機理與生態應用模式

畢銀麗，彭蘇萍，王淑惠

(1.西安科技大學 西部礦山生態環境修復研究院 陜西 西安 710054；2.中國礦業大學(北京) 煤炭資源與安全開采國家重點實驗室 北京 100083)

西部煤礦區是我國礦產資源開發的主產區。該區域屬干旱半干旱氣候，年降雨量少，蒸發量大，土壤貧瘠，生物種群單一。煤炭開采是導致礦區土地退化的直接驅動力，不同煤炭開采工藝對生態環境的損傷特征存在差異，如井工開采致使礦區采煤沉陷地頻發，沉陷裂縫發育損傷植物根系，降低土壤肥力，植被成活率降低，礦區生態環境更加脆弱，生態修復難度增加；露天開采剝離表土，土層搬運堆放致使排土場土壤無結構性，土壤養分低，擾動土壤生物種群銳減，生態重構效果差。為了解決西部礦區土壤生產力的恢復和生態群落重建問題，采用物理、化學和生物修復技術均可為礦區土地復墾提供有力的支持和保障，生物修復技術更具高效與可持續性。以微生物作為提升土壤功能的重要手段，可從根本上系統修復礦區土壤生態系統的功能，挖掘和激發土壤潛在肥力，對加快土壤改良、植被重建，促進礦區生態系統的穩定和可持續發展具有重要作用。

目前微生物復墾技術在煤礦區生態修復中的作用與應用受到越來越多專家學者關注，其中應用最多的微生物是叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF)，該菌已在西部煤礦區取得了良好生態修復效應，技術應用趨于成熟。隨著西部煤礦區微生物生態修復規模化應用，對菌劑的需求量更大。AMF無法純培養，生產周期較長，對宿主植物有一定選擇性，施用范圍受植物種類一定限制。礦區生態修復對菌劑普適性與快速培養的需求使研究者開始關注另外一種微生物，深色有隔內生真菌(dark septate endophytes，DSE)。由于DSE具有廣泛的宿主適應性，作為土壤微生物的重要組成部分，其發揮的生態學功能也引起了學者們廣泛興趣。

DSE泛指一類定殖于宿主植物根表皮、皮層，甚至維管束組織細胞內和細胞間隙，形成深色有隔菌絲和微菌核特征結構的內生真菌。研究表明，DSE具有與AMF相似的生態學功能，能促進宿主生長，提高宿主抗逆性。DSE可以純培養，菌劑可以規模化生產，可為煤礦區大面積退化土地的修復快速提供充足微生物菌劑來源。西部煤礦區擾動土壤養分貧瘠，逆境脅迫(如高溫、干旱、鹽堿化、重金屬污染、酷寒等)致使生態種群單一，生態系統穩定性差，是西部礦區土地復墾與生態修復的主要障礙因子。利用DSE在土壤和植物根系中的生態位優勢，探究其在西部礦區生態修復的應用潛力。筆者主要從DSE的生態功能和礦區生態修復機理方面進行梳理，探索DSE菌劑在西部礦區生態修復的應用模式，為礦區生態修復提供新的技術和應用方向。

1 DSE生態特征

植物根際中存在大量DSE，DSE在空間和宿主植物中均未表現出特異性。有文獻表明在我國西部陜西、內蒙古、新疆和寧夏煤礦區植物根際均發現有DSE定殖，闡明DSE生態特征可為其修復機理奠定基礎。

1.1 DSE分類特征

在顯微鏡下觀察植物根內DSE的形態學特征，深色有隔菌絲和微菌核是DSE的主要特征結構(圖1)。單個菌絲沿根的主軸生長，可以在皮層細胞之間生長，也可以在表皮細胞之間的凹陷處生長。菌絲在皮層細胞間隙延伸并形成菌絲網，有時可延伸至細胞內形成胞內菌絲。菌絲顏色深淺不一，常見為深棕色至淺棕色，且隨著菌絲的延伸，顏色可逐漸變淺。菌絲壁較厚，具明顯的橫隔。菌絲直或曲，常伴有樹枝狀隨意隆起的分枝，并存在菌絲特化結構，如沿植物根細胞內壁盤曲的菌絲圈等。微菌核是由細胞壁膨大加厚的細胞緊密堆積形成，形狀大小不一。顏色多為深棕色，偶見較淺的顏色，分布于表皮、皮層細胞中或細胞間隙，少見于維管組織內，有時可見其與菌絲相連。研究學者根據形態將微菌核定殖結構分為聚合型(腦狀、啞鈴狀)和離散型(帶狀、鏈狀、星點狀等)。

圖1 植物根內DSE定殖結構Fig.1 DSE colonization structure in roots

DSE可進行分離培養。培養基中的DSE菌落多呈圓形或橢圓形，顏色以灰色、黑色和褐色為主，表面平整或隆起具有褶皺，多有絨毛狀覆蓋，有些DSE產球形或橢圓形孢子，有些DSE不產孢。早期使用的長rRNA基因序列分析支持了DSE的多系統起源，DSE分類研究運用核糖體DNA-ITS序列分析技術進行基因序列檢測。分子生物學分類可用于研究形態類群之間的系統發育關系，為更好地了解其與宿主的相互作用奠定了基礎。通過對DSE真菌的分子結合形態系統研究和分類單元的重新評價，將為在形態相似、遺傳序列不同的類群中分離出具有不同生態功能的DSE開辟道路。

1.2 不同宿主植物DSE定殖特點

DSE作為內生真菌，其與宿主植物間的互作關系以及定殖情況均會隨著外界環境條件的不斷變化而變化。植物物候是影響內生真菌在宿主植物中定殖的關鍵因素。研究學者發現最高水平的內生真菌定殖通常發生在宿主植物生長季節的高峰或后期，內生真菌數量的增減取決于植物的營養需求和植物向真菌提供的光合產物輸出量，以及真菌對營養的需求和真菌向植物提供的礦物質營養的數量。這一相互作用反映了隨宿主植物生長季節的變化，植物根系向內生真菌提供光合產物的輸出量不同，2者之間的營養交換發生變化，進而影響內生真菌的定殖情況。DSE定殖與植物物候有關，但目前對于DSE與植物物候之間的關系仍不明確。MULLEN等發現，在生長季節開始時，毛茛屬根內DSE定殖率非常高，促進了植物對氮的吸收。LI Han等研究發現夏季黑果枸杞根內DSE菌絲定殖率高，促進寄主植物對營養物質的吸收和利用；冬季微菌核定殖率高，有助于宿主植物抵御寒冷環境。然而，也有研究學者在高山苔原濕草甸植物群落中對4種多年生草本植物在萌芽期、盛花期、幼果期、果實成熟期和落葉期5個物候期進行采樣研究，發現DSE菌絲定殖率隨著時間的推移和宿主植物的不同均未發生顯著變化。這可能由于不同種類宿主植物的物候期對DSE定殖的影響程度不同。

DSE的宿主范圍較大，且缺乏宿主特異性，同種DSE可以定殖于多種宿主植物，例如，DSE ()能夠定殖大于20個物種，但不同宿主植物根系中DSE定殖率存在差異。植物種類對DSE菌絲定殖率和總定殖率具有顯著直接影響。在濕地生態系統中，DSE的定殖在單子葉植物中比雙子葉植物中更普遍。此外，研究表明DSE在根系較老的部分能更頻繁地定殖，表明DSE更喜歡衰老的根系組織。

1.3 不同生境中DSE生態型

在一個寄主物種中，微生物的生存環境相比宿主的基因型對其影響更大。研究表明從南非沿海平原和低地到熱帶、溫帶、亞高山、高山、海洋南極和北極地區的各種生境的宿主植物根系中均可觀察到DSE的定殖結構，未表現出明顯的區域或環境特異性。隨海拔的升高，DSE菌絲變粗，顏色逐漸變深，橫隔膜縮短；微菌核由分散顆粒狀聚集成簇、成團，并出現迷宮狀，顏色也顯現不同變化規律，且菌絲定殖率、微菌核和總定殖率逐漸增大。

DSE分布和定殖具有明顯的空間異質性，與土壤因子密切相關。一些研究者認為，土壤溫度和土壤濕度在定殖水平中發揮作用。土壤有機質、全氮、全磷、速效鉀、磷酸酶等土壤因子與DSE定殖率密切相關，但不同研究學者對于土壤因子與DSE定殖情況存在正/負相關性差異。土壤重金屬含量也會影響DSE在宿主植物根內的定殖。DSE定殖情況與土層深度也存在相關關系，DSE總侵染率和定殖率隨土層加深而減小。此外，有研究發現根際DSE菌絲定殖率高于根圍。

可見，DSE在不同宿主植物和生境中存在不同的生態特征，但對于宿主植物種類和生境具有廣泛適應性，且對環境的適應性較強，具有普適性。DSE可作為礦區生態修復的菌劑材料。

2 DSE在西部煤礦區生態修復作用機理

西部煤礦區氣候干旱、土壤貧瘠、采煤擾動致使生物種群減少，生態系統脆弱。以微生物作為受損生態系統修復的切入點，可從根本上改善土壤的生物組成結構，提升土壤質量，恢復土地生態系統。礦區修復植被的健康與適應性不僅與植物基因組有關，還與環境中的多種生物因子有著錯綜復雜的聯系。DSE對宿主植物的生態作用是多方面的，其促進宿主礦質營養的吸收，保護宿主免受非生物脅迫(水分脅迫、鹽脅迫、重金屬脅迫、寒冷脅迫等)和生物脅迫(病原菌傷害)都發揮重要作用，可增強生態系統穩定性。

2.1 DSE對宿主植物礦質營養吸收的作用機理

西部礦區土壤貧瘠，磷是關鍵的限制因子。而磷是植物生長發育所必需的大量營養元素之一，在植物體內不僅參與細胞的結構組成，而且在新陳代謝和遺傳信息傳遞等方面都起著重要作用。HASELWANDTER和READ給接種DSE后，發現其能增加植物的生物量和莖稈中的磷含量。JUMPPONEN和TRAPPE研究發現，DSE可以分解不溶性磷酸鹽供宿主植物利用。徐潤冰將DSE菌片分別接種于有機磷和無機磷液體培養基中，發現DSE能分泌酸性磷酸酶和質子，將難溶性磷轉換成可溶性磷酸根。通過對不同磷水平下接種DSE()對玉米磷吸收的影響發現DSE對不同形式的磷酸根吸收功能不同，DSE通過增強植物磷吸收相關基因的表達，促進植物分泌質子，增加細胞內可溶性磷酸根；還可以通過分泌大量酸性和堿性磷酸酶來分解難溶性磷，促進玉米磷元素吸收。

2.2 DSE對宿主植物抗逆性的作用機理

西部礦區生境差，植物的適應性弱而導致生態修復難。DSE對各種逆境，如干旱、低溫、鹽度、重金屬等表現出很強的耐受力。植物可與內生真菌結合以提高其對環境脅迫的耐受性，提高生態修復效率。

..DSE對植物對水分脅迫的抗性作用

在干旱脅迫下，DSE對植物的定殖可以增加植物生物量，調節滲透物質，穩定光合作用參數，降低氣孔導度，減少整體水分損失。LIU YAN等發現接種DSE()可有效降低干旱脅迫對細胞超微結構的損傷，幫助宿主改善根系的形態和構型，擴大根系的吸收范圍，增加根系與土壤的接觸，提高植物適應脅迫環境的能力。此外，接種DSE可以通過調節根系中激素含量水平和比例來調節根系形態和構型，促進根系生長，抵抗干旱脅迫環境，從而提高宿主的抗旱性。在干旱條件下，ZHANG Qiaoming等接種DSE(GM25)促進高粱(L. Moench)生長，加快植株光合速率和蒸騰速率，提高次生代謝產物花青素含量，改善次生代謝相關的酶活性。

..DSE對植物鹽脅迫的抗性機理

鄧勛等在PDA培養基中培養DSE()，發現DSE對NaCl和NaSO耐受性較好。之后，進一步將DSE接種到樟子松苗木中，通過提高宿主植物的抗氧化酶活性，同時降低丙二醛(MDA)和游離脯氨酸含量來緩解鹽脅迫對樟子松苗木的傷害。MATEU等研究發現蘆葦根內的DSE()增強了蘆葦的耐鹽性，提高了在易受海水入侵地區的存活率。此外，DSE自身產生的黑色素、甘露醇和海藻糖等代謝產物可以幫助宿主提高對鹽脅迫的抗性。ZHAN Fangdong等發現黑色素可以消除鹽脅迫產生的自由基，DSE中分離出的黑色素被報道具有很高的抗氧化活性。甘露醇和海藻糖等被認為是保護植物免受非生物脅迫引起的細胞損傷的重要滲透物質，DSE細胞可以吸收來自宿主的蔗糖，最終將其轉化為甘露醇和海藻糖。值得思考的是，干旱和鹽脅迫誘發了類似的整體脅迫(水分虧缺狀態)，觸發了類似的植物早期反應；因此，幫助植物抵御鹽度的微生物也可能使植物耐受干旱脅迫。

..DSE對植物重金屬脅迫的抗性機理

DSE可以將金屬離子或其絡合物直接泵出宿主植物細胞外，通過細胞外螯合防止重金屬元素滲透到細胞內，并在細胞間隔中絡合和隔離重金屬元素以抑制其毒性。例如，DSE可以通過轉運以PCs絡合物或谷胱甘肽絡合物形式存在的重金屬至宿主植物細胞液泡或其他位于細胞質的泡囊中區隔儲存，將金屬離子FeS簇結合物從宿主植物線粒體膜轉運至細胞質中，并區隔儲存。

在蛋白和轉錄水平上，DSE可以通過參與調控宿主植物根系細胞壁合成通路相關基因的表達，激活細胞壁合成關鍵酶的活性，強化細胞壁對根系吸收的游離重金屬離子的固持與區室化作用，進而改變重金屬離子在植物根組織、細胞和亞細胞水平上的分布，限制其向原生質體和地上部分的運輸，以減輕重金屬毒害。此外，利用微陣列或RNA-seq技術進行了DSE和轉錄組研究，以確定其涉及金屬耐受性的基因。這2項研究報告了中谷胱甘肽s -轉移酶和Nramp金屬轉運蛋白的功能特征，這是DSE中惟一可用的功能基因組數據。

..DSE對植物抗寒的作用機理

低溫可引起生物分子間的物理和化學變化，低溫(<15 ℃)和冰凍(<0 ℃)條件對植物的發育有重要的限制。在極地和高山生態系統中，DSE可能對植物養分獲取有積極影響，從而提高植物對寒冷條件的耐受力。UPSON 等研究發現，與對照組相比，在5 ℃條件下，接種6種DSE的可以顯著提高宿主植物的地上和地下生物量。同樣，養分有效性也改變了DSE()和大麥()之間相互作用的結果，在8 ℃條件下，無論土壤養分有效性高或低，植株生物量和粒重均得到提高。

..DSE對植物抗病的作用機理

微生物可以通過增強植物的抵抗力或耐受性，或通過它們對植物病原體的直接拮抗來保護植物免受病原體的傷害。一些研究表明，DSE具有控制植物病害的潛力。DSE()通過積累HO和誘導植物系統抗性保護水稻植株不受稻瘟病病原菌()侵染，DSE()降低了離體卷心菜中黃萎病病原菌()的癥狀，DSE()降低了感染病原菌()的番茄植株的萎蔫病，DSE(sp.)在提供有機氮源的培養基中增強了甜瓜幼苗對病原菌(f. sp.)的抗性。可見，DSE可以通過改變植物的生物化學特性進而提高植物的抗病性或耐受性。DSE可以通過增強植物抗氧化系統，調節抗病相關酶活性和抗病相關物質的含量，提高植物抗病性。此外，還可通過改善植物根際微環境，增加微生物群落穩定性，從而提高植物的存活能力，增強植物抗病性。

2.3 DSE代謝物對宿主植物的刺激效應

3 DSE在西部煤礦區生態修復應用模式

微生物菌劑在礦區生態環境修復領域的應用被認為是可持續技術，具有經濟高效、低能耗、不產生二次污染等特點，礦區微生物修復具有較大的應用潛力和市場。目前關于DSE的研究大多限于DSE生態多樣性調查和室內抗逆機理，對DSE菌劑的開發及生態修復應用仍處于起步階段。利用DSE特性開發出液體應用方法和固體菌劑產品，規模化應用于礦區生態修復將是微生物復墾新的思路和方向。

3.1 DSE菌液浸種搭載無人機飛播生態修復模式

常規液體菌劑野外規模化應用是將液體發酵菌液直接施用于根際土壤，菌劑的需求量大，且液體儲存、運輸成本高，大面積礦區復墾實踐很難推廣。考慮礦區生態修復普遍采用大面積撒播灌草種子，且地形復雜多變，采用低成本高效的菌液浸種搭載無人機飛播技術可實現多物種組合的立體快速生態修復效果(圖2)。

圖2 無人機飛播作業及飛播參數試驗Fig.2 Uar broadcast operation and broadcast parameters test

微生物菌液浸種可以促進植物健康生長，提高植物抗逆性。采用濃度為20%的DSE(sp.)針A2-7的菌液浸泡玉米種子12 h可以促進種子快速萌發，并顯著促進玉米幼苗生長，對于在西部煤礦區植被重建具有重大的應用推廣價值。

無人機飛播具有作業速度快、工作效率高、適用范圍廣、操作便利等優點。在西部采煤沉陷區，可以通過對采煤沉陷區地形圖的坡度分級和地面覆蓋率，確定無人機飛播過程中的撒播系數和飛行參數，如在陜北張家峁礦區飛播豌豆的無人機飛行高度為2 m、飛行速度為4 m/s、材料漏速為8.22 kg/min，作業間距為6 m。通過無人機飛播遙控式作業，不僅可以提高種子撒播均勻度、減少勞動力成本，還可以使地形復雜的西部礦區實現“全覆蓋”生態修復。

3.2 DSE固體菌劑生態修復模式

生長活躍的DSE菌絲體相比微菌核在土壤中生長更快、更活躍。DSE菌液可以濃縮菌絲體干燥后制成DSE固體菌劑膠囊，也可采用礦區本地采礦伴生黏土制丸粒，具有廣闊的應用前景(圖3)。膠囊和丸粒固體菌劑可常溫保存，解決液體菌劑不宜長期儲存且運輸不便等問題。DSE(sp.)針A2-1在60 ℃下干燥，常溫保存20 d仍可保持DSE生物活性，固體菌劑研發可延長DSE菌存活時間，更大程度發揮其促進礦區生態恢復的價值。菌劑接種到根際土壤后繁殖迅速，侵染率高。培養10 d的DSE固體菌劑對紫花苜蓿的促生作用顯著，能夠提高紫花苜蓿的養分吸收能力。

圖3 固體菌劑研制Fig.3 Development of solid bactericide

3.3 DSE菌液葉面肥涂抹生態修復模式

DSE菌液進入土壤后容易被土壤吸附或者固定，影響菌肥效應的發揮，所需菌液量較大，費工費力。將葉面肥DSE菌液以葉片涂抹方式接入，可以最大效率提高菌肥的利用率，產生較好的接菌生態效應，可以提高葉片對菌液有效養分的吸收。DSE菌液代謝物是影響宿主植物和土壤環境的重要化合物，影響植物在分子水平上的反應，促進色素、次生代謝物、激素、抗氧化劑和生物堿的生物合成，這對宿主植物促生等也發揮著重要作用。

盆栽實驗發現，在葉面直接涂抹DSE菌液可以明顯促進蛋白桑生長，提高蛋白桑營養品質(圖4)，對蛋白桑生物量的貢獻率高達226%。采用液相色譜質譜聯用分析(UPLC-MS)檢測DSE菌液代謝產物，含有137余種化合物，包括氨基酸和肽類、有機氧化合物、脂質和類脂質分子、有機雜環化合物、苯丙烷和聚酮化合物等11種類型，其中以氨基酸和肽類為主，占總化合物的36.45%。

圖4 DSE代謝物葉面涂抹效果Fig.4 Foliar coating effect of DSE metabolites

氨基酸和肽類化合物作為葉面肥可以促進植物生長，提高抗凍、抗旱、耐鹽、光合活性和對真菌、細菌和病毒的抵抗力。相比直接施入土壤方式，葉面肥涂抹更為高效。后期需要考慮環境參數的影響(如日照、降水)，需對植物吸收、運輸和利用葉面肥養分的物理、化學、生物和環境等機理進一步探索，進一步提升DSE菌液作為葉面肥的功效。

綜上所述，DSE菌劑產品可對西部煤礦區生態修復產生積極促進作用，有潛在的生態修復利用價值，但DSE生態修復的長期生態效應仍有許多未知需要探索，各種非生物因素(植物種類、土壤pH值、水分、質地、養分和鹽度等)均可能會影響DSE菌劑的定殖和生態效應，DSE對西部礦區生態修復長期作用效果仍有待進一步深入研究。

4 結 語

DSE作為自然界土壤中的一類廣譜真菌，對于促進土壤養分活化，增加植物生物量，抵抗逆境具有重要的作用，可以減緩煤炭開采對土壤性狀和生物種群的損傷，對于煤礦區受損生態修復具有積極促進意義。DSE浸種搭載無人機飛播、固體菌劑研發、DSE葉面肥的開發等多樣化生態修復模式將會為西部煤礦區土地復墾與生態修復提供多樣化的技術支撐，具有重要的現實生態意義。預計在未來，多樣化的DSE菌劑材料將應用礦區生態修復，以加速實現西部礦區的生態、社會和經濟效益。

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