適合繡球屬植物的無菌播種技術改良

沈柏春，余磊，邱帥，孫麗娜，彭悠悠，魏建芬，高凱

(杭州市園林綠化股份有限公司，浙江 杭州 310020)

繡球(Hydrangeamacrophylla)又名八仙花，為虎耳草科繡球屬植物，其花大色艷、品種繁多且花期長，是重要的園林綠化、盆花及干鮮切花資源。繡球屬有73個種，而中國就擁有53種，占所有資源的73%，是繡球屬的資源分布中心。其花色、花形、葉色和葉形等觀賞性狀及適應性具有豐富的遺傳多樣性[1]，開發(fā)潛力大，但育種工作起步晚[1]，目前僅有9個品種獲得植物新品種權，新品種培育速度慢，商業(yè)化水平低。目前，歐美和日本已成為繡球屬植物的繁育中心，已建立了完善的商業(yè)化育種體系，培育品種主要為大葉繡球(H.macrophylla)、喬木繡球(H.arborescens)、圓錐繡球(H.paniculata)和櫟葉繡球(H.quercifolia)等，形成魔幻、無盡夏和女士等系列品種[1-3]，其他種栽培品種少，開發(fā)利用程度較低。

通過高效的播種技術，能夠快速獲得大量具有豐富遺傳變異的后代，這是培育植物新品種的基礎。無菌播種是提高播種效率的常用技術。繡球屬的果實為蒴果，含有大量微小種子，種子成熟時，仍為鮮嫩狀，含水量較高，從果實中分離難度大。對新鮮果實進行表面滅菌，再分離出鮮種子進行無菌播種，以此獲得的雜交種子數(shù)較少，且萌發(fā)率低，很難獲得較大規(guī)模的篩選群體[3-11]。此外，繡球的種皮極薄，易被滅菌劑滅活。Nesi等[4]研究表明，直接滅菌的種子，發(fā)芽率極低。

為提高繡球播種效率，本研究針對其果實和種子特點，改良常規(guī)無菌播種技術，降低了操作難度，提高了有效種子獲得率，能快速獲得大規(guī)模篩選群體，此法適用于繡球雜交和臘蓮繡球(H.strigosa)、柳葉繡球(H.stenophylla)、掛苦繡球(Hydrangeaxanthoneura)和中國繡球(H.chinensis)等野生資源的無菌播種，為繡球屬雜交育種和野生資源的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以大葉繡球和喬木繡球種內雜交果實及野外采集的繡球屬野生種果實為供試材料，人工授粉于2018年在杭州市園林綠化股份有限公司青山湖研發(fā)基地進行。大葉繡球種內雜交組合為帝沃力♀×塔貝♂、夢幻藍♀×塔貝♂和塞布麗娜♀×塔貝♂，喬木繡球種內雜交組合為貝拉安娜♀×粉色貝拉安娜♂和無敵貝拉安娜♀×粉色貝拉安娜♂，每個組合授粉500～600朵。選擇三四年生健壯無病蟲的容器苗作為母本，置于溫室中培養(yǎng)。5—6月進行人工授粉。花苞膨大微張時，采集花藥，去除雜質，置于干燥器中，使用變色硅膠干燥劑進行干燥；花藥干燥至散粉時，收集花粉于2 mL離心管中，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｔ谀副镜幕ò虼笪垥r，剪去雄蕊，次日將花粉小心涂抹于柱頭。授粉后，保持溫室溫度20～28 ℃，每天早晚各澆水1次，施用A2緩釋肥20～50 g一次，每周噴施500倍濃度的50%多菌靈1次。授粉后120～150 d，果實膨大，逐漸成熟，當萼片自然失水、變硬，果實未干燥時，采集果實保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

野生種果實于2018年8—9月在貴州雷公山自然保護區(qū)、梵凈山自然保護區(qū)、翁安縣和堯人國家森林公園等地采集，通過比對花、果、葉和莖等特征確定其種，并采集新鮮果實以冰袋保存，快遞至杭州市園林綠化股份有限公司青山湖研發(fā)基地進行無菌播種。共采集圓錐繡球(H.paniculata)、臘蓮繡球、柳葉繡球(H.stenophylla)、掛苦繡球(H.xanthoneura)和中國繡球(H.chinensis)等5個繡球屬野生種的果實。

1.2 方法

采用4種方法進行繡球無菌播種，其中，T1～T3為常規(guī)方法[3-7,9,12]，T4為改良無菌播種。T1是對種子進行滅菌，將新鮮果實充分干燥后收集種子，將種子置于洗潔劑、10%次氯酸鈉混合液中磁力攪拌30 min，自來水沖洗1 h備用，在超凈工作臺上，將種子用75%乙醇浸泡10～15 s，再用0.1%升汞浸泡2～5 min，其間不斷搖動，然后用無菌水沖洗5次，將種子均勻撒入萌發(fā)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。T2～T4是對新鮮果實進行表面滅菌，果實的滅菌方法同T1，但0.1%升汞浸泡為25 min。果實滅菌后，改良無菌播種(T4)是將變色硅膠干燥劑、濾紙和培養(yǎng)皿進行高溫滅菌，并將變色硅膠干燥劑放入烘箱中充分干燥，至變?yōu)樗{紫色后充分冷卻，平鋪于培養(yǎng)皿中，厚度為培養(yǎng)皿高度的三分之一，并覆蓋濾紙；將滅菌后的果實晾干1 h，均勻平鋪于濾紙上，蓋上蓋子，用撕拉膜封口，放入干燥器中，干燥2～5 d，待果實充分干燥后，在超凈工作臺上將干燥后的果實取出，用無菌刀將果實頂部切開，用無菌鑷子輕柔的擠壓果實，將種子擠出，均勻撒入萌發(fā)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；T2是用無菌刀將果實縱切后放入萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；T3是在解剖鏡下用無菌刀切開果實，將種子小心挑出，放入萌發(fā)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

不同繡球種和雜交組合每種方法播種果實60顆，萌發(fā)培養(yǎng)基為B5基本培養(yǎng)基+0.7%卡拉膠+2.0%蔗糖，pH調至5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照時間12 h/d，光強2 500 lx，播種后觀測統(tǒng)計不同播種方法的污染率、種子萌發(fā)情況和幼苗生長情況。種子萌發(fā)后，當幼苗長至0.5 cm以上時，將其接入生根培養(yǎng)基MS+0.1～0.2 mg·L-1萘乙酸+0.7%卡拉膠+2.0%蔗糖，pH調至5.8。培養(yǎng)40～80 d后，幼苗主根發(fā)達，具有3～6個須根，當75%幼苗高度達到5 cm以上時，將組培瓶苗置于溫室苗床上煉苗，進行75%遮蔭。3～7 d后，用自來水洗凈幼苗殘留培養(yǎng)基，將根部插入基質中，置于(25±2)℃全光照噴霧溫室中進行煉苗，調整噴霧間隔時間和持續(xù)時間，使相對濕度保持在80%～90%，每隔10 d噴灑500倍多菌靈溶液。培養(yǎng)35～60 d后，形成健壯的繡球實生苗。待幼苗高度長至3～6 cm時，移至口徑為150 cm的紅素盆中，種植于室外，夏季遮陰，進行正常水分管理。10月移至1加侖容器中，繼續(xù)培養(yǎng)至開花年齡。

2 結果與分析

2.1 不同無菌播種方法的污染率

如表1所示，T2的污染率最高，為32.4%～63.2%；其次為T1，為5.9%～17.8%；T3和T4的污染率最低，為2.7%～12.3%。滅菌方法和培養(yǎng)材料不同可能是污染率相差較大的原因。T1是對種子直接滅菌，考慮到升汞對種子的影響，升汞滅菌時間較短，僅為2～5 min，因此，污染率較高。T2～T4都是對果實外表皮進行滅菌，雖然升汞滅菌時間達到25 min，但外表皮溝壑較多，無法充分滅菌，而果實內部為相對無菌，因此，T2(帶外果皮播種)的污染率最高，T3和T4(果實內部干凈種子播種)最低。此外，采用相同無菌播種方法，人工授粉的繡球雜交果實污染率遠低于野生繡球果實，這可能是野外環(huán)境比溫室環(huán)境微生物較多造成。

2.2 不同無菌播種方法的萌發(fā)、生長和生根情況

大葉繡球種內雜交、錐繡球、臘蓮繡球、柳葉繡球、掛苦繡球和中國繡球采用4種方法進行無菌播種，種子都能萌發(fā)，但萌發(fā)時間和萌發(fā)率差異較大。如表1所示，T1的萌發(fā)時間最長，需要29.3～43.1 d，萌發(fā)率也最低，僅為0.03%～0.31%，表明升汞滅菌易損傷繡球種子，導致發(fā)芽率下降。T2萌發(fā)時間較短，但萌發(fā)率較低，僅切口處的種子能夠萌發(fā)，果實內部的種子極少萌發(fā)。T3和T4萌發(fā)最快，10.2～17.6 d即可萌發(fā)，發(fā)芽率最高，最高可達95.6%。

表1 不同播種方法的萌發(fā)情況

從平均每顆果實萌發(fā)數(shù)來看，T4為最高，其次為T3，而T2和T1最少。雖然T1、T2和T4能獲得果實內所有種子，但T1的滅菌方式對種子損傷大，T2僅有果實切開處種子能夠萌發(fā)，平均每顆果實萌發(fā)數(shù)較低；而T4僅對果實進行表面滅菌，種子無損傷，干燥分離后的種子均勻播種于培養(yǎng)基上，充分吸收養(yǎng)分和水分，每顆果實萌發(fā)數(shù)高；T3雖然萌發(fā)率高，但種子分離難度高，損失較多，每顆果實萌發(fā)數(shù)較低。

喬木繡球種內雜交果實采用T4進行無菌播種，其種子無萌發(fā)。其他3種方法中，T1的萌發(fā)時間長，萌發(fā)率也最低；T2萌發(fā)時間短，萌發(fā)率低；T3萌發(fā)時間短，萌發(fā)率較高。3種方法平均每顆果實萌發(fā)數(shù)都較低。萌發(fā)后，4種無菌播種方法獲得的幼苗生長和生根情況無顯著差異，在30～50 d后都能正常生根，生根率在98%以上，且根系飽滿。但不同來源的幼苗差異較大，種內雜交幼苗生長快，植株強健，30 d左右開始生根；野生種幼苗生長較慢，43 d左右開始生根。

2.3 煉苗移栽后生長情況及開花情況

經(jīng)過煉苗移栽后，4種無菌播種獲得的幼苗生長表現(xiàn)相似，但不同來源的幼苗差異較大。種內雜交后代生根速度和生長速度都比野生種幼苗快。前者煉苗10 d左右開始有新根長出，后者煉苗15 d左右才開始有新根長出。煉苗45 d后，種內雜交后代和野生種幼苗根系飽滿，但前者植株高于后者。

大葉繡球種和喬木繡球種內雜交后代在2020年首次開花，開花率為43%和53%，在2021年全部開花。野生種中，圓錐繡球、臘蓮繡球、掛苦繡球和中國繡球在2020年首次開花，開花率為35%～47%，2021年全部開花。柳葉繡球生長較弱，未開花。

3 小結與討論

無菌播種技術是提高種子萌發(fā)率的重要手段，已成功應用于繡球育種工作中。但繡球種子極小，分離困難，已報道的研究常采用解剖鏡下切開果實、挑出幼嫩種子的方法，效率極低，種子損失大，很難獲得大量的雜交后代[4,11]，本研究也出現(xiàn)相同問題。Nesi等[4]將收集的成熟種子進行滅菌，以期解決無菌狀態(tài)下種子分離難的問題，但結果表明，對種子直接滅菌導致發(fā)芽率極低。陸乙卜等[12]采用相同的方法收集野生圓錐繡球成熟種子，滅菌后萌發(fā)率顯著降低，幼苗生長受到抑制。本研究中將種子滅菌后進行培養(yǎng)，也出現(xiàn)種子損傷嚴重甚至褐化死亡的現(xiàn)象。Nesi等[4]將果實滅菌并切開進行培養(yǎng)，僅切口處種子能夠萌發(fā)，果實內部種子萌發(fā)少，本研究也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。

本研究依據(jù)繡球屬果實和種子特點，改良無菌播種技術，將滅菌后的果實在無菌環(huán)境中充分干燥，收集種子進行培養(yǎng)，操作簡單、污染率低、種子損失小、萌發(fā)率高，能快速獲得大量的雜交后代，1～2 a達到開花年齡，可作為新品種培育的篩選群體，有效縮短繡球新品種選育周期，可應用于繡球屬雜交育種以及臘蓮繡球、柳葉繡球、掛苦繡球、圓錐繡球和中國繡球等野生資源的開發(fā)利用。