腫瘤精準治療新策略
——靶向調控DNA損傷修復功能的長鏈非編碼RNA

蘇小茉， 張美英， 高嬡嬡， 郭明洲

中國人民解放軍總醫院第一醫學中心消化內科醫學部，北京 100853

隨著對長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在生長發育和各種生命活動中功能的認識，其在疾病發生發展及診治中的應用價值也被高度關注。lncRNA在腫瘤中的表達異常已被廣泛報道，但獲得lncRNA全長序列，并明確其在腫瘤中的作用和機制的lncRNA數量非常有限。與蛋白編碼基因不同，lncRNA的數量非常龐大，目前仍無法準確獲得基因組編碼lncRNA的總數。由于lncRNA在基因組上的分布比較廣泛，絕大多數的lncRNA與蛋白編碼基因部分或完全重疊，導致其功能研究受到蛋白質編碼基因的影響，如常用的基因敲降或敲除技術均可能同時影響非編碼RNA和蛋白編碼基因的功能。因此，目前絕大多數報道的具有系統功能研究的lncRNA均為基因間lncRNA。隨著各種前沿生物技術的發展，絕大多數尚未被解析的lncRNA，將不斷被明確其在腫瘤等復雜性疾病中的作用及機制，為疾病的診斷和防治提供新的策略。

1 lncRNA概述

非編碼RNA是近年來被人們認識的一類新的轉錄子，雖然由基因組編碼但不翻譯為蛋白質。非編碼RNA在各種細胞功能和生命活動中發揮著重要作用。目前認為，>75%的人類基因組均具有轉錄功能，并編碼大量的非編碼RNA[1-3]。lncRNA是一類長度>200 nt的非編碼RNA，在染色質結構重塑、基因表達調控、細胞生長和分化、發育，以及各種信號通路的調控中均發揮重要作用。由于lncRNA功能的多樣性和復雜性，隨著其數量的不斷增加，如何將發現的大量lncRNA轉錄子分類已成為一個挑戰性的問題。根據在基因組上的位置，將其分為基因內(位于內含子)、基因間(兩個蛋白編碼基因之間)、增強子(位于啟動子區和增強子區)、雙向(位于編碼基因附近的對應鏈，opposite strand)、有義鏈重疊(與各種編碼基因的一個或多個外顯子和內含子在有義鏈重疊)和反義(在DNA的反義鏈)lncRNA。根據其功能將lncRNA分為信號通路(與特定的信號通路相關)、誘餌(捕獲轉錄因子或抑制因子)、引導(與具有調控作用或酶活性的蛋白復合物結合引導到特定的靶基因啟動子區或基因組的某一特定位點調控下游基因或信號通路的功能或基因表達)、支架(作為與各種蛋白復合物結合的關鍵平臺，并引導至特定的基因組位點或靶基因啟動子區調控基因的表達及染色質的構象)[4-5]。人的lncRNA數量預計為2×104～1×105個或更多[6]。然而，目前發現的絕大多數lncRNA的功能和作用機制仍不清楚，并且還有大量的lncRNA有待發現。很多lncRNA在各種腫瘤中異常表達，且一些lncRNA的異常表達具有腫瘤特異性。由于某些lncRNA具有組織/細胞特異性，因此有望獲得新的腫瘤特異性診斷標志物和個體化治療靶標。

lncRNA的異常表達與腫瘤的發生和轉移密切相關，有一些lncRNA扮演癌基因角色，而另一些扮演抑癌基因角色。因此，發現新的與腫瘤相關的lncRNA并明確其功能和作用機制，有望在腫瘤診斷和治療方面獲得新的突破，然而目前仍面臨許多挑戰性的問題。雖然，應用高通量測序等技術進行轉錄組分析，能夠在不同腫瘤中分離出大量異常表達的lncRNA轉錄本或片段，然而弄清這些lncRNA的功能和機制是一項極具挑戰性的工作[5]。在腫瘤中發現的大量上調或下調的lncRNA或其片段，如何獲得具有重要功能的lncRNA也是一個挑戰性的問題。目前，由于絕大多數lncRNA的結構和生物功能尚未注釋，因此該領域仍處于起步階段。在未弄清lncRNA的結構和功能之前而發展的基于lncRNA的治療方法，就像是在黑暗中打槍一樣缺乏明確的目標。另外，與蛋白編碼基因不同，lncRNA在種屬間非常不保守，在體外和動物模型中獲得的lncRNA的結構和功能的信息，以及治療策略，并不一定適合在人類疾病中的應用，仍然需要結合人類疾病的臨床標本檢測及進一步的試驗。因此，需要直接從人類疾病樣本中分離和鑒定出新的lncRNA，并對其功能和作用機制進行深入研究[5, 7]。

2 lncRNA對腫瘤相關信號通路的調控作用

腫瘤相關lncRNA已成為腫瘤生物學最主要的熱點。大量的證據表明，異常表達的lncRNA通過不同的信號通路促進細胞的持續增殖和代謝異常，最終導致腫瘤的產生、進展和轉移[8]。

lncRNA BC032913通過上調TIMP3的表達和抑制β-catenin的核轉位而抑制Wnt信號通路，抑制結腸癌的轉移[9]。lncRNA CCAL通過激活Wnt信號通路而促進細胞的增殖、侵襲、遷移和細胞周期的進展，導致結腸癌的發生和發展[8，10]。lncRNA MALAT1通過增加PI3K和AKT磷酸化激活PI3K/AKT信號通路，導致胃癌細胞對順鉑的耐藥[11]。LINC01503通過激活ERK/MAPK和PI3K/AKT信號通路而促進食管癌細胞的侵襲和遷移。AK001796通過激活P53信號通路而影響食管癌的生長[12]。在結腸癌和肝癌中，lncRNA MT1JP通過與TIAR相互作用而激活P53信號通路[13]。lncRNA CDKN2B-AS通過調控hTERT的表達而影響食管癌的生長。MALAT1、SNHG16等lncRNA通過影響EMT而促進食管癌的轉移[12，14-17]。lncRNA NORAD通過激活TGF-β信號通路而促進肺癌的轉移[18]。lncRNA gadd7可通過與TDP-43相結合誘導Cdk6 mRNA的降解而影響DNA損傷修復(DNA damage repair，DDR)[19-22]。lncRNA-p21通過調控Hippo信號通路而抑制胃癌的轉移[23]。lncRNA VESTAR在食管癌中通過直接與VEGFC mRNA的相互作用而促進其穩定性，有望成為食管癌淋巴結轉移患者的治療靶標[24]。

3 DDR機制及腫瘤的“協同致死”治療策略

在自然情況下，每天每個細胞可以通過各種內外因素發生2×105個DNA損傷。外部因素包括紫外線、輻射和基因毒性藥物[25-26]，以太陽光來源的紫外線照射為例，每天每個細胞可以誘導1×105個DNA損傷[26-27]。內源性因素多數來自于代謝的副產物，如活性氧。細胞輕度DNA損傷可以經過修復而恢復正常；不能完全修復將導致基因的突變或缺失，累積性的癌基因激活突變(驅動基因突變)或抑癌基因缺失將導致腫瘤的發生。嚴重的DNA損傷如不能修復將會通過染色體災難等死亡機制導致損傷細胞的死亡。

為了應對DNA損傷，生物進化出幾個具有部分重疊或互補功能的DDR通路。在哺乳類動物細胞內有7個主要的DDR通路，包括直接修復(direct repair)、錯配修復(mismatch repair，MMR)、堿基切除修復(base excision repair，BER)、核苷酸切除修復(nucleotide excision repair，NER)、同源重組修復(homologous recombination repair，HR)、經典非同源末端連接修復(classical non-homologous end joining，cNHEJ)和選擇性末端連接修復(alternative end joining，Alt EJ)[28-30]。腫瘤的關鍵治療方法之一，就是利用放療或化療藥物誘導腫瘤細胞的DNA損傷，而腫瘤細胞DDR的缺陷增加其對放化療的敏感性[29，31]。

“協同致死”的概念源于對果蠅遺傳模型的研究，用于描述兩個或更多基因同時發生突變而導致細胞的死亡[32]。在腫瘤治療中“協同致死”的基本原理是，腫瘤細胞中的一個DDR通路存在缺陷，通過其另外的補償通路而存活，阻斷該補償通路將導致腫瘤細胞死亡。最經典的例子是在BRCA1/2突變而表達缺失的細胞，應用PARP抑制劑導致細胞的死亡[29，33-35]。在腫瘤中，應用PARP抑制劑治療BRCA1/2突變的細胞是一個完美的“協同致死”治療模型，目前幾乎所有的“協同致死”研究均局限于BRCA1/2的突變。然而，BRCA1/2突變在多數腫瘤中均非常少見。隨著對DDR機制的深入理解，新的針對DDR關鍵分子的靶向治療成為抗腫瘤治療的新策略。約有450個基因編碼參與DDR的蛋白均可能成為潛在的治療靶標。大量的DDR關鍵分子的抑制劑仍在進行臨床試驗，如：CBP-501和Prexasertib(CHK1/2抑制劑)、AZD-1775(WEE1抑制劑)、AZD-6738和VX-970(ATR抑制劑)、LY-3023414(DNA-PK抑制劑)和AZD-0156(ATM抑制劑)[31，36]。

通過對該模型生物學功能的學習和深度分析，發現在腫瘤中具有與BRCA1/2突變相似的功能異常改變時，應用與BRCA1/2突變腫瘤同樣的治療方案可以獲得同樣的效果，稱之為“BRCAness”[37]。“BRCAness”可以是其他DDR相關基因的異常，如ATM、ATR、PALB2、MGMT等，或與細胞命運相關/或參與細胞周期的信號通路的功能異常改變，如：Notch、PI3K/AKT、ERK等信號通路的功能異常；根據Knudson“二次打擊”學說，“BRCAness”既可以是基因突變，也可以是表觀遺傳異常，如DNA甲基化或lncRNA表達異常等[38-40]。因此，明確不同信號通路之間的補償機制和調控網絡將極大地促進“協同致死”策略的發展和應用。基于“BRCAness”、Knudson“二次打擊”學說和“協同致死”原理，我們在食管癌中發現NRN1甲基化沉默時，PI3K和ATR抑制劑具有“協同致死”效應[38]。同時，在肺癌中發現TMEM176A甲基化沉默和ATM抑制劑(AZD0156)具有“協同致死”效應[39]。這是我們首次根據Knudson“二次打擊”學說、“協同致死”原理和“BRCAness”原理，成功建立的基于表觀遺傳異常的“協同致死”策略的例證。

基于表觀遺傳異常所導致的基因/信號通路功能缺失(loss of function)，特別是DDR基因、細胞周期調控基因和細胞命運相關基因的表觀遺傳沉默，為腫瘤的“協同致死”提供了新的治療策略[29，31，36，41-42]。在此基礎上有望解決在腫瘤中應用經典靶向治療無法解決的問題，如突變導致的抑癌基因功能缺失或表觀遺傳異常導致的基因表達缺失的“undruggable”靶標。值得注意的是，“協同致死”原理可以用于探索在腫瘤中無法靶向的異常改變，通過靶向其具有補償功能的伙伴而達到特異性殺傷腫瘤細胞的目的[43]，如抑癌基因突變或表觀遺傳異常導致的基因表達缺失。

4 lncRNA、DDR、細胞命運及其在“協同致死”策略中的應用前景

目前，對于lncRNA的認識仍處于初始階段，大量新的在腫瘤異常表達的lncRNA或片段不斷被發現，但明確其功能仍然是一個具有挑戰性的問題。近年的研究發現，lncRNA具有明顯的組織/細胞特異性或腫瘤特異性的特點，并發現部分lncRNA通過調控腫瘤相關信號通路而影響腫瘤的發生和發展。某些lncRNA可直接或間接地調控細胞命運或DDR相關基因而影響腫瘤細胞對放化療的敏感性。Sharma等[44]通過比較新制癌菌素(neocarzinostatin)、喜樹堿(camptothecin)和依托泊甙(etoposide)誘導前后hTert永生化人纖維母細胞lncRNA的表達，鑒定出在這三種化療藥物誘導下均高表達的lncRNA DDSR1(DNA damage-sensitive RNA1)。進一步的研究發現，lncRNA DDSR1通過同源重組修復方式(homologous recombination repair, HRR)促進DNA損傷的修復。Shahabi等[45]在腫瘤中鑒定出lncRNA LINC00261通過磷酸化激活ATM而促進DNA損傷修復。lncRNA SPARCLE(suicidal PARP-1 cleavage enhancer)結合PARP-1促進其降解而影響DNA的損傷修復[46]。lncRNA Aerrie(LINC01013)通過與YBX1相互作用促進DNA的同源重組修復[47]。lncRNA也可通過參與Wnt、PI3K、AKT等信號通路而參與DNA的損傷修復。由于深度測序技術和表觀基因組前沿技術的發展，新的lncRNA的數量快速增加，且在腫瘤中異常表達lncRNA的數量也在不斷增加。目前，最具挑戰性的問題是如何明確lncRNA的特征和闡明其功能和在腫瘤中的作用機制。隨著更多與DDR或細胞命運相關lncRNA特性的明確，靶向這些關鍵lncRNA或其補償通路關鍵分子的分子靶向治療或“協同致死”治療將具有更廣泛的應用前景。