轉基因復合抗蟲耐除草劑玉米BFL4-1的分子特征及功能評價

鄒俊杰， 徐妙云， 張蘭， 鄭紅艷， 王磊，2*

（1.中國農業科學院生物技術研究所，農業農村部農業基因組學重點實驗室（北京），北京 100081；2.三亞中國農業科學院國家南繁研究院，海南 三亞 572024）

通過轉基因技術可以獲得具有抗蟲、耐除草劑、抗病、抗逆性、適應性、高產、高營養價值等新性狀的作物品種［1］。轉基因作物的應用能夠有效提高農業生產力，降低干旱、洪澇和病蟲害等對作物生產的不利影響，提高單位面積產量，減少農藥化肥的使用及其對環境的污染［2］。國際農業生物技術應用服務組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）2018年報告中指出，自1996年轉基因作物開始商業化種植以來，全球轉基因作物的種植面積增長了約113倍，累計達到了25億hm2，轉基因作物為消費者提供了多樣性的選擇，在糧食安全、可持續發展及氣候變化等方面作出了貢獻［3］。

轉基因作物的研究呈現多基因、多性狀疊加趨勢，即由轉化單一基因向多基因發展，表現的性狀由單一性狀向復合性狀發展［4］。復合性狀轉基因植物能夠同時表達2個或多個外源基因，聚合多個優良性狀，能夠有效提高資源利用效率，帶來多重收益。國際上已有約120個復合轉化體批準商業應用，復合的性狀以抗蟲抗除草劑、多基因抗蟲復合為主，涉及的作物主要包括棉花、玉米、大豆和油菜等［5］。聚合抗蟲、耐除草劑、耐干旱脅迫，加上營養改良等性狀的復合性狀轉基因產品是未來轉基因作物育種的重要發展方向［6］。2018年，具有復合性狀的轉基因作物種植面積占轉基因作物總面積的42%［3］。

玉米是我國主要糧食作物之一，玉米螟等蟲害和雜草嚴重影響玉米的生長、產量和品質。利用轉基因技術培育具有抗蟲、耐除草劑性狀的玉米是控制害蟲和防除雜草的有效途徑。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性昆蟲病原體，對哺乳動物等非靶標生物安全無害，cry、cyt和vip基因編碼的殺蟲蛋白是主要活性物質，表達Bt殺蟲蛋白的轉基因植物已被廣泛應用于害蟲的防治［7］。草甘膦（glyphosate）可有效地清除雜草，cp4epsps來源于土壤根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）CP4株系，其編碼蛋白CP4EPSPS（5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶）對草甘膦不敏感，導入cp4epsps能使轉化體耐受草甘膦，在耐除草劑轉基因育種中被廣泛應用［5］。我國自2008年啟動轉基因生物新品種培育重大專項以來，已獲得了眾多具有知識產權的轉基因抗蟲和耐除草劑玉米優良轉化體，這為培育具有突破性的玉米新品種創造了條件［2］。這些具有抗蟲耐除草劑復合性狀的轉基因玉米材料進入到環境釋放、生產性實驗和安全證書申報等不同階段。2019年12月，大北農DBN9936以及杭州瑞豐生物科技有限公司和浙江大學申報的雙抗12-5抗蟲耐除草劑玉米獲得農業農村部頒發的農業轉基因生物安全證書，轉基因玉米品種審批有望加快推進。本課題組前期研究構建了cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因串聯表達載體，并通過農桿菌介導法轉入玉米中，經過篩選獲得具有抗蟲、耐草甘膦復合抗性的轉基因玉米材料BFL4-1。本研究利用全基因組測序和側翼序列測序對外源片段插入位置進行了分析，對cry1Ab、cry1F、cp4epsps基因在BFL4-1轉基因材料的分子特征和遺傳穩定性進行了分析，同時對轉基因玉米的抗蟲和耐除草劑性能進行了評價，旨在為培育具有抗蟲和耐除草劑復合性狀的玉米新品系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

轉基因抗蟲耐除草劑玉米BFL4-1由本課題組創制，BC4F1、BC5F1和 BC6F1為 BFL4-1 不同回交世代材料。非轉基因對照材料為玉米自交系鄭58（Zheng 58）由本課題組保存。試驗在中國農業科學院生物技術研究所溫室和位于海南省三亞市樂東縣尖峰鎮的中國農業科學院生物技術研究所試驗基地進行，轉基因材料種植管理嚴格按照《農業轉基因生物安全評價管理辦法》執行，并已備案（農基安辦報告字〔2014〕第595號）。每個小區面積為6 m2（2 m×3 m），行距50 cm，株距20 cm，3次重復，播種后按正常栽培管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 BFL4-1轉基因材料的獲得 根據玉米的密碼子使用頻率對抗蟲基因cry1Ab、cry1F和抗草甘膦基因cp4epsps的密碼子進行了優化，將cry1Ab、cry1F和cp4epsps3個基因表達框構建到植物表達載體pCAMBIA1300上（圖1）。利用農桿菌介導玉米幼胚轉化方法［8］將外源基因表達框（大小約11 kb）導入受體玉米材料Hi?II中，經過篩選獲得多個T1代陽性植株。利用回交轉育的方法將外源插入片段導入自交系鄭58中，經過6代回交再自交篩選后獲得BFL4多個獨立轉基因株系，本試驗用到的轉基因株系為BFL4-1。

圖1 cry1Ab、cry1F和cp4epsps插入表達框的結構Fig.1 Structure of T-DNA region containing cry1Ab，cry1F and cp4epsps expression cassettes

1.2.2 PCR檢測轉基因植株 取玉米幼苗期的葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒（DP302-03，全式金公司）提取基因組DNA。用全基因組重測序方法結合生物信息學分析方法［9］確定BFL4-1的插入位置和序列。根據表達框序列及外源序列插入玉米基因組的位置，設計了cry1Ab、cry1F和cp4epsps特異性擴增引物以及BFL4-1外源片段插入基因組特異性檢測引物，如表1所示。

表1 本研究中引物序列Table 1 Primers used in this study

PCR（聚合酶鏈式反應）體系：2×TSINGKE Master Mix 10 μL；正反向引物（10 μmol·L?1）各0.4μL；ddH2O 8.2μL；DNA模板，1μL。PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35個循環；72 ℃，10 min。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 分別提取BFL4-1拔節期根、莖和葉片的RNA并反轉錄成cDNA，參照試劑盒SV Total RNA Isolation System（Promegam，USA）和反轉錄參照試劑盒A3500-Reverse Transcription System（Promega，USA）說明書進行。qRT-PCR反應體系按照SYBR PremixExTaqTM（Code DRR041A，TaKaRa公司）熒光定量試劑盒進行，采用ABI 7500熒光定量PCR儀系統（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems，美國）進行熒光定量PCR。實時熒光定量用的引物序列如表1所示，zSSIIb為參照基因，試驗結果為3次數據平均值。

1.2.4 外源蛋白免疫試紙條檢測 采用美國Agdia公司的Cry1Ab/1Ac、Cry1F和CP4EPSPS試紙條檢測BFL4-1轉基因材料中的Cry1Ab、Cry1F和CP4 EPSPS蛋白，具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.5 農藝性狀調查 生長期間調查出苗期、抽雄期和吐絲期，吐絲后測量株高和穗位高。果穗收獲后進行考種，測量穗行數和行粒數等農藝性狀指標。種子萌發率參照梁海生等［10］方法進行計算。

1.2.6 玉米螟田間抗蟲性鑒定 轉基因材料及非轉基因對照材料生長到大喇叭口期，開始接種亞洲玉米螟，將玉米螟初孵幼蟲接于心葉中，每株接蟲20～30頭，定期觀察蟲害發生情況。抗蟲性標準采用國際玉米螟協作組制定的9級分級標準［11］。亞洲玉米螟初孵幼蟲購自中國農業科學院植物保護研究所。

1.2.7 抗草甘膦性能評價 在轉基因材料及非轉基因的野生型對照材料生長到4～5片葉時，噴施41%的草甘膦異丙胺鹽（農達，美國孟山都公司），噴施時按15 mL·L?1藥量進行，約為正常用藥的5倍。噴施1周后，調查幼苗死亡率。

2 結果與分析

2.1 BFL4-1轉基因材料的遺傳穩定性檢測

將cry1Ab、cp4epsps和cry1F3個基因串聯表達，通過農桿菌介導法導入玉米中，經過與鄭58回交轉育，獲得了多個獨立的轉基因株系，其中包括BFL4-1和BFL4-2。提取BFL4-1和BFL4-2株系不同世代（BC4F1、BC5F1、BC6F1）陽性植株DNA，采用cry1Ab、cry1F和cp4epsps表達框片段特異引物進行目的基因片段擴增，利用BFL4-1外源基因片段特異性PCR對BFL4-1回交轉育后代進行了連續3代的跟蹤檢測，在不同世代均能檢測到3個目的基因的特異片段（圖2）。這些結果說明，cry1Ab、cry1F和cp4epsps3個基因均已整合到玉米基因組中，并且能夠穩定遺傳。

圖2 在BFL4株系不同世代中cry1Ab、cry1F和cp4epsps片段PCR檢測Fig.2 PCR detection of cry1Ab，cry1F and cp4eps expression cassettes in different generations of BFL4 line

2.2 BFL4-1外源片段插入位置鑒定

BFL4-1回交后代PCR檢測的陽性植株與陰性植株比例接近1∶1，與單個外源片段插入回交株系理論分離比接近，符合孟德爾遺傳規律，說明BFL4-1中外源基因片段插入在玉米染色體基因組上，且為單拷貝插入。

利用新一代的測序技術對轉基因植株的插入位置、插入拷貝數、外源基因的完整性和遺傳穩定性進行分子特征檢測［9］。對獲得的BFL4-1進行了高通量全基因組測序和側翼序列PCR測序分析，并與玉米基因組序列B73 RefGen_v4（http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index）進行比對，發現外源插入片段5’端位于第3號染色體66 921 452 bp附近，外源插入片段位于基因間區。對BFL4-1材料5’端側翼序列進行特異性PCR檢測和測序，擴增片段大小在550 bp左右，與理論片段大小符合，對PCR擴增片段進行測序，測序結果能夠比對上玉米基因組序列和插入片段序列，說明BFL4-1特異性引物對可以用于BFL4-1轉基因株系的特異性檢測。

2.3 BFL4-1材料中cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因相對表達量和蛋白表達檢測

cry1Ab、cry1F和cp4epsps3個基因整合在BFL4-1基因組中且能夠穩定遺傳，為了檢測這3個基因在不同組織中相對表達水平，利用qRT-PCR對3個基因在BFL4-1拔節期不同組織的表達量進行了檢測。cry1Ab、cry1F和cp4epsps在BFL4-1不同組織中表達量相對穩定（圖3）。在成熟期利用Cry1Ab、Cry1F和CP4EPSPS蛋白特異的免疫試紙條定性檢測BFL4-1材料中這3個蛋白的表達情況，檢測結果顯示在BFL4-1的根、莖、葉和種子中均能檢測Cry1Ab、Cry1F、CP4EPSPS蛋白（圖3）。這些結果說明，在BFL4-1材料中，cry1Ab、cry1F和cp4epsps在轉錄和翻譯水平上均能夠穩定表達。

圖3 cry1Ab、cry1F和cp4pesps相對表達量和免疫試紙條檢測Fig.3 Relative expression level of cry1Ab，cry1F，cp4pesps and immunostrip tests

2.4 BFL4-1株系田間抗蟲和抗除草劑性能鑒定

cry1Ab、cry1F和cp4epsps在BFL4-1株系中高效地轉錄，并且在植物各個組織部位均有蛋白表達。為了檢測BFL4-1是否具有高效抗蟲和耐除草劑的性狀，對BFL4-1轉基因株系的抗蟲和耐除草劑性能進行了鑒定。草甘膦噴施一周后，非轉基因植株全部死亡，而轉基因植株存活率為100%，說明獲得BFL4-1為高耐草甘膦的轉基因玉米（圖4A）。在玉米大喇叭口期進行田間接蟲鑒定，結果表明，接蟲后非轉基因植株葉片蟲害嚴重，而BFL4-1具有較好的抗蟲性，根據國際玉米螟協作組制定的抗蟲標準分級對BFL4-1的抗蟲性進行分級，BFL4-1為高抗玉米螟轉基因材料（圖4B）。

圖4 BFL4-1材料田間耐除草劑和抗蟲性能評價Fig.4 Evaluation of herbicide tolerance and insect resistance of BFL4-1 plants in the field

2.5 BFL4-1農藝性狀與對照比較

為了研究外源基因片段插入后是否影響玉米農藝性狀，對BFL4-1與鄭58的生育期、株高、穗位高、穗行數、行粒數和百粒重等農藝性狀進行了觀察和比較，結果表明，在正常種植條件下，轉基因BFL4-1植株與對照鄭58在株高、穗位高、生育期、抽雄期、穗行數、行粒數、百粒重以及萌發率無差別，適應性與對照鄭58相當，說明BFL4-1與鄭58在生存競爭力方面均無明顯差異（P＞0.05，表2）。這些結果說明，在正常條件下轉基因BFL4-1農藝性狀與非轉基因對照材料鄭58相比未發生變化，沒有增加或減少適應性的優勢或趨勢。在田間農業生產過程中，因BFL4-1可以耐受草甘膦除草劑，同時含有抗蟲基因，在玉米螟蟲害嚴重時，其生長性能要優于對照鄭58。

表2 BFL4-1與對照鄭58農藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between BFL4-1 and Zheng 58

3 討論

來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt基因需要進行密碼子優化才能在玉米中穩定表達，通過提高蛋白表達量來提高轉基因玉米的抗蟲性能。已有研究報道，根據玉米密碼子的偏好性對來自蘇云金芽孢桿菌BT8的cry1Ah進行優化，優化后cry1Ah的GC含量提高，并且細菌基因中16處易引起mRNA不穩定的ATTA序列也得到了改造，優化后的cry1Ah與Btcry1Ah基因序列相似性為70%左右［12］。cry1Ab在轉基因玉米中存在表達量低、表達產物不穩定和抗蟲效果差等問題，通過對cry1Ab基因原始核苷酸序列改造，去掉引起mRNA不穩定及富含AT的序列，并經過密碼子優化，能夠獲得新型的抗蟲基因cry1Ab-Ma，并具有很強的殺蟲性［13］。通過對Btcry1Ah和G2-epsps基因進行植物密碼子優化改造，能夠提高轉基因玉米的抗蟲和耐除草劑性能［11］。本研究獲得的轉抗蟲耐除草劑玉米BFL4-1材料中cry1Ab、cry1F和CP4EPSPS均具有較高的表達，蛋白表達穩定（圖3），田間抗蟲和耐除草劑試驗結果表明轉基因玉米材料BFL4-1為高抗玉米螟和耐除草劑的轉基因株系（圖4）。

具有復合性狀成為轉基因作物研發的趨勢，2018年，復合性狀轉基因作物的種植面積占全球轉基因作物種植面積的42%，越來越受到種植者的歡迎［3］。復合性狀轉基因植物可以通過共轉化、再轉化和育種復合3種途徑獲得，復合的性狀以抗蟲抗除草劑、多基因抗蟲復合為主［5］。目前，具有復合性狀的轉基因玉米主要通過親本雜交聚合法、多基因單載體共轉化聚合法和多基因多載體共轉化聚合法等來獲得［14］。國內通過這些方法也獲得了具有復合性狀的轉基因玉米，包括一些抗蟲耐除草劑玉米品系［15］等。有些轉基因玉米除了抗蟲耐除草劑外，還兼具有耐旱性能［16］。通過將cry1Ab、cry1F和cp4epsps串聯表達并轉入玉米中，整合在染色體上并能夠穩定表達，一方面縮短了轉基因復合育種的過程；另一方面多基因抗蟲，能夠延緩靶標生物產生抗性，延長轉基因玉米的使用壽命。

本研究獲得了具有抗蟲耐除草劑復合性狀的轉基因玉米材料BFL4-1，對其分子特征進行了分析，cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因的表達具有遺傳穩定性，且在農藝性狀上與對照無顯著差異。在今后田間抗蟲性鑒定方面，除了玉米螟外，還需要對其他鱗翅目害蟲，如棉鈴蟲、黏蟲以及桃蛀螟的抗性進行鑒定，這些害蟲也嚴重影響玉米生長發育［17］。復合性狀轉基因作物在營養成分含量上與非轉基因作物可能存在差異，這可能與轉基因作物中包含的多個基因間存在協同、抑制或非關聯相互作用有關［18］。后續還需要對轉基因玉米BFL4-1進行毒性、過敏性分析及環境安全評價和營養成分分析，為轉基因玉米BFL4-1的安全評價申報和培育奠定基礎。