低磷脅迫下3種不同種源葛藤的生長生理響應

張淑煒， 趙麗麗， 陳超， 譚景晨， 張莉， 席溢

（貴州大學動物科學學院，貴陽 550025）

磷是植物生長發育必需的營養元素，以多種方式參與植物體內各種生理生化過程，是影響植物生長和高產的主要因素之一[1-2]。土壤普遍缺磷已成為制約我國農業發展的重要限制因素。施用磷肥作為增加植物產量的常用措施，雖能緩解土壤有效磷缺失，但極易與土壤中鐵、鋁、鈣、鎂離子等形成不溶性化合物，難以被植物吸收利用。此外，磷酸鹽礦物資源屬于不可再生資源。據估計，磷礦資源儲量將在百年內耗盡[3]。磷肥過量使用不僅會造成磷源匱乏、成本增加，還易導致水體富營養化、缺氧等環境污染問題[4]。不同類型植物對低磷脅迫的調節能力不同。核桃[5]、辣椒[6]、柑橘[7]幼苗在低磷脅迫下，側根、須根、根長和根冠比增加，主根變粗、伸長減緩，根系與土壤的接觸面積擴大，以提高植物對磷的吸收利用率。馬尾松在低磷脅迫下表現出葉綠素和可溶性蛋白含量以及根系活力降低，丙二醛、可溶性糖和和游離脯氨酸含量增加，植物保護酶活性提高，以此相互轉化維持植物體內物質代謝，保護酶系統大量清除自由基形成動態平衡的生理應答機制[8]。而黃花、苜蓿在低磷脅迫下，生物量、株高、根表面積、總根長、根體積等表觀形態指標顯著降低[9]。因此，研究植物在低磷脅迫下的應激反應對農業和畜牧業的可持續發展具有重要意義。

葛藤（Pueraria lobate）為豆科（Leguminosae）葛屬（Pueraria）多年生纏繞型藤本植物，適應性強、耐寒、抗旱、耐瘠薄等。葛藤根系發達，扎根深，能改良土壤結構，有效防止徑流和侵蝕、保水保土、防風固沙，是喀斯特石漠化地區生態恢復的先鋒植物[10]。目前，對葛藤的研究主要集中在飼用[11]、藥用[12]、生態價值[13]等方面，而關于葛藤對低磷脅迫的響應和生理適應機制少見報道。本研究以3個不同來源葛藤材料為研究對象，通過水培法探究葛藤幼苗期在低磷水平下的生理生化變化，以期助推葛藤種質資源的利用和耐低磷品種選育，為進一步指導葛藤生產實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以來源于澳大利亞（Austrilia，A）和我國江蘇（Jiangsu，J）和湖南（Hunan，H）3個種源的葛藤種子為試驗材料。其中，澳大利亞葛藤種子由江蘇岡仁波齊種業有限公司提供，江蘇葛藤種子由江蘇種業科技有限公司提供，湖南葛藤種子購自湖南種子市場。

1.2 試驗方法

選取大小均勻、飽滿的葛藤種子用質量分數3%NaClO浸泡20 min，滅菌蒸餾水沖洗種子3～4次直至沖洗干凈，再浸泡種子6 h后均勻地撒在鋪有兩層濾紙的培養皿中，放在光照14 h/黑暗10 h、溫度25℃/22℃的光照培養箱中催芽，每天澆1次蒸餾水使濾紙保持濕潤。培養約7 d，當長出2葉1心時，挑選大小一致的幼苗移入長49.5 cm、寬20 cm、高15 cm的塑料盆中進行水培。移苗時使用1/2營養液（表1），5 d后換為全營養液，全營養液培育14 d后進行低磷處理。

葛藤幼苗通過恒溫培養進行脅迫，設置常磷0.5 mmol·L?1KH2PO4（P0.5）、低 磷 0.05 mmol·L?1KH2PO4（P0.05）和 極 低 磷 0.005 mmol·L?1KH2PO4（P0.005）3個處理水平，以3個種源葛藤為試驗材料共計9種處理，即P0.5A（常磷+澳大利亞葛藤）、P0.05A（低磷+澳大利亞葛藤）、P0.005A（極低磷+澳大利亞葛藤）、P0.5H（常磷+湖南葛藤）、P0.05H（低磷+湖南葛藤）、P0.005H（極低磷+湖南葛藤）、P0.5J（常磷+江蘇葛藤）、P0.05J（低磷+江蘇葛藤）、P0.005J（極低磷+江蘇葛藤）。每個處理設3次重復，每盆30株為1次重復，共27盆。葛藤幼苗以打孔海綿條固定，每3 d更換營養液，每次1 L。更換營養液時隨機挪動每盆葛藤位置，以降低光照等因素的影響。同時在低磷營養液中分別加相應的氯化鉀以補足缺失的鉀元素，其余營養液成分均相同（表1），最后用HCl或NaOH調節營養液pH至6.0～6.2。

表1 營養液成分及濃度Table1 Concentration of nutrient solution components

1.3 指標測定與方法

脅迫處理20 d后，測量葛藤的農藝性狀和生理指標。

1.3.1 農藝性狀的測定 采用直尺和游標卡尺測量株高和莖粗，設3次重復，每個重復測量10株；使用葉片掃描儀測定葉面積、葉周長等葉片指標；根系掃描儀測定根長、根表面積、根直徑等根系指標；將葛藤幼苗分為地上部和地下部，稱其鮮重，之后105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重稱其干重；根、葉表型指標均設3次重復，每個重復4株。根據公式（1）計算根冠比。

1.3.2 生理指標的測定 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定，可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍G-250法測定[14]；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外吸收法測定，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創木酚法測定，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用NBT光還原法測定，脯氨酸（proline，Pro）含量采用酸性茚三酮法測定[15]。

采用耐低磷系數綜合評價低磷處理對3個種源葛藤生長特性的影響。正相關指標的耐低磷系數根據公式（2）計算[16]；負相關指標的耐低磷系數根據公式（3）計算。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2013進行數據整理，應用SPSS 22.0軟件進行數據分析，Sigmaplot 14.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫對葛藤幼苗生長特性的影響

2.1.1 低磷脅迫對生物量的影響 低磷脅迫下，不同地區葛藤的各項指標變化明顯不同（表2）。與常磷條件相比，澳大利亞和江蘇葛藤在0.005 mmol·L?1磷條件下的株高、莖粗、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、地下部干重均呈下降趨勢，降幅分別為 14.61%、3.22%、3.62%、8.44%、12.98%、6.00%、5.04%、10.15%、29.80%、38.34%、34.83%、37.33%；其中，江蘇葛藤地上部和地下部鮮重以及地上部干重在不同處理間差異顯著。極低磷條件下，澳大利亞和江蘇葛藤幼苗根冠比較常磷呈上升趨勢，增幅分別為9.90%、3.19%，說明0.005 mmol·L?1磷條件有利于澳大利亞和江蘇葛藤幼苗根冠比的增加；而在0.005 mmol·L?1磷條件下，湖南葛藤的株高、地上部鮮重和地上部干重均呈上升趨勢，增幅分別為31.76%、30.37%、6.35%，莖粗、地下部鮮重、地下部干重和根冠比呈下降趨勢，降幅分別為1.65%、28.93%、27.50%、38.86%（表2）。由此表明，湖南葛藤在0.005 mmol·L?1磷脅迫下可能是通過降低地下生物量和增加地上生物量的方式適應環境。在0.05 mmol·L?1磷條件下，3個種源葛藤的地上生物量和地下部鮮重均有上升趨勢，三者的地上部鮮重差異顯著（P＜0.05），湖南和江蘇葛藤的地上部干重差異顯著（P＜0.05）。

表2 低磷脅迫下葛藤幼苗的生物量Table 2 Biomass of Pueraria lobata seedlings under different low phosphorus stresses

2.1.2 根系形態 低磷脅迫下，不同地區葛藤之間根系形態指標變化趨勢基本一致（表3）。與常磷相比，0.05 mmol·L?1磷條件下3個種源葛藤根系的總根長、根表面積、根直徑、根體積、根尖數、根毛數均呈上升趨勢；其中，澳大利亞葛藤的總根長、根直徑、根尖數于常磷處理差異顯著（P＜0.05），總根長、根尖數增幅分別為77.01%、49.43%。0.005 mmol·L?1磷條件下，3個種源葛藤總根長、根表面積、根直徑、根體積、根尖數、根毛數較常磷處理均小幅下降；澳大利亞葛藤的根尖數、根毛數和湖南葛藤的總根長、根尖數以及江蘇葛藤的根體積、根尖數與常磷處理差異顯著（P＜0.05）。

表3 低磷脅迫下葛藤幼苗的根系形態Table 3 Root morphological of Pueraria lobata seedlings under different low phosphorus stresses

2.1.3 葉片形態 低磷脅迫下，3個種源葛藤的葉片形態指標都隨磷濃度降低而呈現先增大后減小的趨勢。與常磷相比，湖南葛藤在0.05和0.005 mmol·L?1磷條件下都有良好的促進作用。湖南葛藤在0.05 mmol·L?1磷條件下增幅最大，其葉面積、葉周長、葉長和葉寬較常磷處理分別提高了46.57%、24.53%、20.65%、21.32%。在極低磷條件下，各指標雖在低磷的基礎上呈減小趨勢，但較常磷各指標仍分別增加了21.19%、11.84%、8.36%、32.03%，說明低磷環境對湖南葛藤葉片形態指標有促進作用。與常磷相比，江蘇葛藤和澳大利亞葛藤在0.05 mmol·L?1磷條件下的葉面積、葉周長、葉長、葉寬明顯增加；澳大利亞葛藤葉片各指標較常磷差異顯著（P＜0.05），而江蘇葛藤各葉片指標差異不顯著；在0.005 mmol·L?1磷條件下，江蘇葛藤和澳大利亞葛藤變化趨勢一致，均較常磷處理有所降低，但差異不顯著，說明極低磷環境對江蘇葛藤和澳大利亞葛藤葉片發育有抑制作用。

表4 低磷脅迫下葛藤幼苗的葉片形態指標Table 4 Leaf morphological indexes of Pueraria lobata seedlings under different low phosphorus stresses

2.2 低磷脅迫對葛藤幼苗滲透調節物質的影響

3個種源葛藤根、葉中脯氨酸含量隨磷水平降低呈逐漸增加趨勢，在極低磷處理時3個種源葛藤脯氨酸含量達到最大（圖1）。與常磷處理相比，澳大利亞、湖南、江蘇葛藤根部和葉片脯氨酸含量在 0.005 mmol·L?1磷處理下分別顯著增加145.42%、84.79%、36.70% 和 49.41%、64.66%、92.89%（P＜0.05）。3個種源葛藤根、葉可溶性糖含量變化表現一致，均隨磷水平降低呈逐漸增加趨勢，在0.005 mmol·L?1磷處理達最大。與常磷相比，澳大利亞、湖南、江蘇葛藤在 0.05 mmol·L?1磷條件下根部和葉片中可溶性糖含量分別顯著增加67.85%、38.95%、14.01% 和 46.66%、55.46%、54.72%（P＜0.05）。3個種源葛藤在低磷脅迫下根和葉中可溶性蛋白含量變化趨勢一致，均為常磷處理＞0.05 mmol·L?1磷處理＞0.005 mmol·L?1磷處理（圖1）。澳大利亞和湖南葛藤均在常磷處理時根、葉中可溶性蛋白含量最大，顯著高于其余處理（P＜0.05）。與常磷相比，澳大利亞和湖南葛藤在0.005 mmol·L?1磷處理下根和葉片的可溶性蛋白分別顯著降低37.34%、61.58%和32.33%、46.40%。江蘇葛藤可溶性蛋白含量隨磷水平降低也呈逐漸降低趨勢，但根部可溶性蛋白含量在各處理間差異不顯著（P＞0.05）；與常磷相比，江蘇葛藤在0.005 mmol·L?1磷條件下葉片中可溶性蛋白含量顯著降低26.94%（P＜0.05）。

圖1 不同處理下葛藤幼苗的滲透調節物質含量Fig.1 Contents of osmotic adjustment substances of Pueraria lobata seedlings under different treatments

2.3 低磷脅迫對葛藤幼苗抗氧化酶系統的影響

2.3.1 低磷脅迫對葛藤丙二醛含量的影響 3個種源葛藤根、葉中丙二醛含量隨磷水平降低先降低后增加（圖2）。與常磷處理相比，澳大利亞、湖南、江蘇葛藤在0.005 mmol·L?1磷處理下根部丙二醛含量分別顯著增加24.37%、33.23%、45.61%（P＜0.05），而葉片中丙二醛含量分別顯著增加36.38%、58.03%、55.95%（P＜0.05）。

圖2 不同處理下葛藤幼苗的丙二醛含量Fig.2 Contents of MDA of Pueraria lobata seedlings under different treatments

2.3.2 低磷脅迫對葛藤抗氧化酶活性含量的影響 圖3表明，3個種源葛藤抗氧化酶活性隨磷水平降低均呈逐漸增加趨勢。與常磷相比，澳大利亞、湖南和江蘇葛藤在0.005 mmol·L?1磷條件下根系SOD活性分別顯著增加47.54%、50.60%、21.76%（P＜0.05），葉片中SOD活性分別顯著增加52.57%、32.54%、97.79%；澳大利亞、湖南和江蘇葛藤在 0.005 mmol·L?1磷條件下根系和葉片中POD活性分別顯著增加129.29%、39.12%、33.14%和53.61%、38.62%、70.56%；澳大利亞、湖南和江蘇葛藤在0.005 mmol·L?1磷條件下根系和葉片中CAT活性分別顯著增加118.43%、78.46%、22.01%和131.76%、92.00%、20.13%。

圖3 低磷脅迫下葛藤幼苗的抗氧化酶活性Fig.3 Activities of antioxidant enzyme in Pueraria lobata seedlings under different low phosphorus stresses

2.4 綜合分析

根據耐低磷系數公式計算求各指標的耐低磷系數。若耐低磷系數＞1，說明葛藤在該指標上耐低磷性好；若耐低磷系數＜1，說明葛藤在該指標上不具有耐低磷性或者耐低磷性較差。由表5可知，在低磷和極低磷條件下，3個種源葛藤24個指標的耐低磷系數均發生了變化。

表5 不同地區葛藤各單項指標的耐低磷系數Table 5 Low phosphorus tolerance coefficient of every single index of Pueraria lobate

與常磷相比，3 個種源葛藤在 0.05 mmol·L?1磷處理下的根冠比及SP、MDA含量降低；地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、總根長、根表面積、根直徑、根體積、根尖數、根毛數、葉面積、葉周長、葉長、葉寬和SS、Pro含量及SOD、POD、CAT活性增加；澳大利亞和江蘇葛藤株高降低、莖粗增加，湖南葛藤株高增加、莖粗降低。由此表明，3個種源葛藤均具有較強的耐低磷性，0.05 mmol·L?1磷條件下葛藤在形態上表現為：矮小粗壯、葉面積增大、根系變長、根系機能活性減弱。

與常磷相比，3個種源葛藤在0.005 mmol·L?1磷處理下的莖粗、地下部鮮重、地下部干重、總根長、根表面積、根直徑、根體積、根尖數、根毛數和SP含量降低；SS、Pro含量及SOD、POD和CAT活性增加；澳大利亞和江蘇葛藤株高、地上部鮮重、地上部干重、葉面積和葉寬降低，根冠比增加，湖南葛藤反之；澳大利亞和湖南葛藤葉周長和葉長增加，江蘇葛藤反之。3個種源葛藤在0.005 mmol·L?1磷處理下根系變短、根毛和根尖數減少、根冠比增加，澳大利亞和江蘇葛藤植株矮粗，湖南葛藤植株細長，生物量及其分配特征變化均表現為地上部生物量增加、地下部生物量降低。不同種源葛藤對環境脅迫的響應表現出差異性。綜合所有指標的耐低磷系數得出，3個種源葛藤的耐低磷性表現為：澳大利亞葛藤＞湖南葛藤＞江蘇葛藤，即澳大利亞葛藤耐低磷性較強，江蘇葛藤為低磷敏感型。

3 討論

3.1 葛藤幼苗生長特性對低磷脅迫的響應

植物在缺磷環境下會出現不同表型以適應環境變化，反映了植物體內不同的生物學適應機制。根系是植物從環境中攝取養分的重要器官，在養分缺乏時根系的變化起著十分重要的作用[17]。研究表明，玉米、水稻、大豆等植物在低磷脅迫下不僅會改變根系形態，還會使同化物向根部的運輸量增加，導致根冠比增加，以此促進根系對磷素的吸收，提升利用效率[18-21]。除根系外，植物的株高、葉面積、葉周長等形態指標也能直觀反映植物在逆境中的受傷害程度。本研究結果表明，隨著磷濃度的降低，澳大利亞葛藤的株高、根冠比和根直徑呈先下降后上升趨勢，地上部干重、總根長、總根表面積、總根尖數、根毛數、葉面積、葉周長、葉長、葉寬呈先上升后下降趨勢，地下部干重和總根體積呈下降趨勢；湖南葛藤的根冠比和根直徑呈先下降后上升的趨勢，地上下部干重、總根長、總根表面積、根體積、根毛數、葉面積、葉長、葉寬和葉周長呈先上升后下降的趨勢，根尖數呈下降趨勢，株高呈上升趨勢；江蘇葛藤的地上部干重、根直徑、根尖數、葉長、葉寬、葉面積和葉周長呈先上升后下降趨勢，根冠比和株高呈先下降后上升趨勢，地下部干重、總根長、根表面積、總根體積和根毛數呈下降趨勢。3個不同種源的葛藤種質在低磷條件下的生長特性表現出明顯差異。一般來說，植物對磷的吸收主要依靠于根系長度和表面積，并通過側根探索更大的磷接觸面積[22]。磷在植物光合作用中作為底物參與調節葉綠素合成，低磷條件下，葉綠素的合成受阻，葉片擴展速率降低，植物光合碳同化能力降低，導致植株生長矮小，地上生物量降低，同時地上部光合產物優先分配到根系，使根系生長加快，增加根系生物量[23]。在 0.05 mmol·L?1磷水平下，澳大利亞葛藤表現出了較江蘇和湖南葛藤更長的根長、更大的根表面積及更多的根尖數和根毛數，這與Wang等[24]對馬鈴薯的研究結果一致，說明澳大利亞葛藤在低磷脅迫下具有較強的自我調節能力，把地上部光合產物更多地轉移到根系，使其耐低磷能力更強。湖南葛藤在低磷脅迫下表現為植株細長，根冠比減小，地上部受影響較小，地上生物量仍較大，這說明湖南葛藤在低磷脅迫下可能并非僅通過增加根系指標來適應環境，這與王嵐[25]的研究結果一致，可能是地上部光合產物向根部轉移的量變化較小，與根部激素調控相關。江蘇葛藤在低磷脅迫下生物量降低，根系僅靠根尖獲取磷，這可能是其耐低磷能力相對較弱的原因。本研究采用水培法進行試驗，并不能完全模擬植物根系在復雜土壤環境中的變化，故未來在指導生產實際前應通過大田試驗或者從分子水平進一步驗證。

3.2 葛藤幼苗滲透調節物質對低磷脅迫的響應

在逆境下，植物體內會發生一系列的生理生化反應，形成適應機制[26]。受到脅迫后，植物體內會通過累積大量的Pro和SP維持滲透平衡，以更好地適應逆境[27]。SS是植物碳水化合物代謝、暫時貯藏的方式之一，逆境下SS含量顯著升高[28]。本研究結果表明，隨著磷濃度的降低，3個不同種源葛藤根和葉片中SS、Pro含量均呈上升趨勢，SP含量呈下降趨勢，與龔絲雨等[29]對煙草和李俊等[30]對油茶的研究結果一致。

3.3 葛藤幼苗抗氧化酶系統對低磷脅迫的響應

逆境下植物體內會累積過多的活性氧自由基（reactive oxide species，ROS），破壞正常代謝中ROS產生與清除之間的平衡，最終使細胞膜系統受損。MDA是植物脂質過氧化反應的產物，其含量反映了植物受脅迫傷害的程度[31]。本研究表明，0.05 mmol·L?1磷水平下，3個不同種源葛藤根和葉片中MDA含量呈小幅度下降趨勢，說明葛藤具有一定的耐低磷性，在該濃度磷脅迫下，植株受損害程度較輕；0.005 mmol·L?1磷水平下，3種葛藤體內MDA含量均大幅度上升，說明該濃度磷脅迫導致葛藤體內自由基累積，加劇了細胞膜脂過氧化作用。其中，江蘇葛藤根和葉片中MDA含量顯著高于湖南和澳大利亞葛藤，說明0.005 mmol·L?1磷水平下江蘇葛藤的受損害程度更高。同時，植物在逆境脅迫下為了抵御自由基對自身造成的傷害會增強抗氧化防御系統[32]，即SOD將O2?轉化為O2和H2O2，而POD和CAT可清除、催化H2O2分解為無毒物質[33-34]。本研究表明，3個種源葛藤根和葉中SOD、POD、CAT活性在低磷脅迫下均呈現不同程度的上升，與喬光等[8]對馬尾松和余小芬等[35]對水稻的研究結果一致，說明葛藤在低磷脅迫下通過自動調節提高保護酶活性，從而提高細胞防御能力，保障體內的正常生理代謝。

本研究通過分析3個種源葛藤種質進行低磷脅迫20 d后的形態變化和生理響應得出，葛藤在低磷條件下具有極強的適應性和較好的產量潛力。3個種質中，澳大利亞葛藤的耐低磷性較強，江蘇葛藤屬于低磷敏感型。