骨軟骨組織工程仿生梯度支架研究進展

萬 李，王海蟒，蔡 谞，胡刻銘，岳 文，張洪玉*

(1 中國地質大學(北京) 工程技術學院，北京 100083；2 清華大學 機械工程系 摩擦學國家重點實驗室，北京100084；3 清華大學附屬北京清華長庚醫院 骨科,北京102218；4 清華大學臨床醫學院，北京 102218)

骨軟骨缺損是導致老年人骨關節炎和關節殘疾的重要原因[1]。在骨關節炎發展過程中，關節軟骨將會變薄和退化，關節間隙變窄，骨贅形成和軟骨下骨重塑[2]。在骨關節炎早期階段，疼痛和僵硬是主要表現癥狀，因此治療方法主要是物理療法、服用鎮痛藥和非甾體類消炎藥減輕疼痛[3]。隨著骨關節炎的發展，如果軟骨缺損的范圍和程度仍然很小，那么在此階段微骨折骨髓刺激是行之有效的治療方法。微骨折骨髓刺激法是一種微創手術，首先去除受損的軟骨，然后于軟骨下骨下表面形成孔道，使血液和骨髓穿過軟骨下骨/軟骨界面，其中包含的間充質干細胞有助于形成和修復軟骨和軟骨下骨。然而，再生軟骨主要為纖維軟骨，它不具有與天然關節軟骨類似的耐久性。在骨關節炎中晚期階段，骨軟骨組織自體或異體移植、組織工程支架和膝關節局部表面置換可用于治療中小型病變[4]。如果骨軟骨缺損已發展到非手術治療不再有效的階段，則必須進行全關節置換手術。全關節置換外科手術通常不能恢復關節的全部功能，并且伴隨高并發癥率風險。因此，開發一種修復受損骨軟骨組織的方法具有非常重要的臨床意義[5-7]。

骨軟骨組織工程匯集了工程學、材料科學、生物學和化學的原理和方法，旨在開發骨軟骨仿生梯度支架，恢復、維持或改善受損骨軟骨組織的功能[8-9]。該學科涉及多種細胞類型、支架材料和生長因子與細胞因子，它克服了同種異體骨軟骨移植和自體組織移植的限制[10]。性能優異的生物材料和適當的制造方法在開發理想的骨軟骨仿生梯度支架方面起著至關重要的作用。目前，研究人員已開發了用于制備三維多孔骨軟骨仿生梯度支架的天然聚合物材料、合成聚合物材料和生物活性材料[11]。骨軟骨仿生梯度支架的制造方法可分為常規方法和3D打印方法。常規的支架制造技術(例如溶劑澆鑄[12]、靜電紡絲[13]、氣體成型和冷凍干燥[14])具有一定的成本效益，且可以對骨軟骨仿生梯度支架的孔隙率和孔徑進行控制。3D打印技術可對骨軟骨仿生梯度支架的宏觀和微觀特征進行獨立的調控，進一步開發具有特定結構的骨軟骨仿生梯度支架[15]。

骨軟骨缺損通常涉及軟骨和軟骨下骨的損傷。相關研究表明，具有離散或連續梯度特性的骨軟骨仿生梯度支架在修復骨軟骨缺損方面優于單相組織支架[16-17]。通過縫合、膠合或壓入配合可制造雙相或三相離散梯度支架，然而大多數此類型支架具有結合強度不足的缺點，因而增加了植入后相分層的風險[18-19]。連續梯度支架不易發生相分層，具有在軟骨和軟骨下骨之間提供平滑過渡的潛力，可促進應力在骨軟骨仿生梯度支架內的傳遞，避免界面不穩定并更加相似地模擬骨軟骨組織的自然結構[3,20]。本文總結了骨軟骨組織的生化組成、結構和力學性能的梯度特征，并介紹了3D打印技術和有限元建模方法在骨軟骨梯度支架制造方面的研究進展。

1 骨軟骨組織的生化組成、結構和力學性能

骨軟骨組織由軟骨和軟骨下骨組成，具有特定的骨軟骨單元結構梯度和生物學特性。因此，設計骨軟骨仿生梯度支架，必須了解其組成、結構和功能的骨軟骨單元。

1.1 骨軟骨組織的生化組成和結構

骨軟骨組織具有特定的自然梯度，它是由從軟骨表面到軟骨下骨的生化組成、結構和力學特性的變化來定義的[21-23]。骨軟骨組織由軟骨和軟骨下骨兩部分組成[6，24]，如圖1(a)所示。軟骨可分為非鈣化軟骨和鈣化軟骨。非鈣化軟骨包含3個區域，即深層區域、中間區域和淺表帶[25]。軟骨主要由水、細胞外基質(主要是Ⅱ型膠原纖維)和軟骨細胞組成[26]。膠原纖維的直徑和方向由軟骨的表層區域到深部區域發生變化，表層區域包含最細的膠原纖維(30～35 nm)，它以與關節表面高度平行的方向排列，膠原纖維的直徑在軟骨的中部增加，在軟骨的深部，膠原纖維的直徑為40～80 nm，取向垂直于關節表面，以增強軟骨與軟骨下骨之間的結合強度[27]。

圖1 骨軟骨組織結構(a)骨軟骨單元：軟骨和軟骨下骨[6，24](Tidemark表示礦化和非礦化軟骨之間的離散帶)；骨的宏觀(b)、微觀(c)和納米(d)結構[24]Fig.1 Structure and properties of osteochondral(a)osteochondral unit: cartilage and subchondral bone[6](Tidemark denotes a discrete band between mineralized and non-mineralized cartilage);macrostructure(b), microstructure(c) and nanostructure(d) of bone[24]

鈣化軟骨位于骨軟骨組織的過渡區域，該區域的膠原纖維錨固在軟骨下骨上，用于固定軟骨和軟骨下骨。鈣化軟骨下方是軟骨下骨，由水(約10%，質量分數，下同)、有機成分(Ⅰ型膠原蛋白約30%)和礦物質成分組成[28]。軟骨下骨是高度血管化的生物礦化結締組織，具有很高的機械強度和結構復雜性。天然軟骨下骨組織在宏觀結構、微觀結構和納米結構水平上具有明顯的層次性(圖1(b)～(d))。在宏觀結構水平上，軟骨下骨可分為皮質骨和松質骨。在微觀結構水平上，皮質骨由重復的骨單位組成，而松質骨由小梁骨的互連框架組成，且形成了骨髓填充的空間。每個骨質都有20～30個同心膠原纖維層，繞著哈弗氏管并包含各種血管和神經[29]。在納米結構水平上，存在大量的膠原纖維、磷酸鈣晶體和非膠原有機蛋白[30]。

1.2 骨軟骨組織的力學性能

骨組織中的細胞包括成骨細胞、破骨細胞、成熟骨細胞和間充質干細胞。成骨細胞與形成新軟骨下骨和羥基磷灰石的合成有關，破骨細胞與骨吸收有關，骨細胞可調節成骨細胞和破骨細胞之間的相互作用[31]。骨組織的力學性能在很大程度上取決于骨細胞外基質的特定結構和組織。骨軟骨組織的結構和力學特性從軟骨表面到軟骨下骨各不相同。軟骨呈凝膠狀結構且孔隙率為60%～85%，軟骨細胞由流過軟骨孔的關節液提供營養物質。皮質骨具有高剛度，其孔隙率為5%～30%，隨著孔隙率的增加，剛度從皮質骨到小梁骨逐漸降低，小梁骨的孔隙率為30%～90%。軟骨下骨組織中的多孔結構充滿了血管和神經纖維，這些血管和神經纖維為骨細胞提供營養并清除廢物[23-24]。軟骨的抗壓模量和抗壓強度從表層到深部逐漸增加，抗壓模量從0.2 MPa增大到6.44 MPa，抗壓強度從0.005 MPa增大到4 MPa[11,22]。由于有機和無機成分的排列，軟骨下骨組織具有各向異性。例如，皮質骨的橫向彈性模量和縱向模量分別為10.1 GPa和17.9 GPa，縱向拉伸強度和抗壓強度分別為135 MPa和205 MPa，橫向拉伸強度和抗壓強度分別為53 MPa和131 MPa[21-22]。表1[11]總結了天然骨軟骨組織的組成、結構和力學性能。骨軟骨組織表現出從軟的軟骨到硬的軟骨下骨的梯度轉變，因此，在骨軟骨組織工程中，實現這種梯度轉變具有非常重要的意義。

表1 天然骨軟骨組織的組成、結構和力學性能[11]Table 1 Summary of composition,structure and mechanical properties of natural osteochondral tissue[11]

2 骨軟骨組織工程中的細胞、生長因子和材料

骨軟骨缺損通常包括關節軟骨破壞和軟骨下骨缺損。當前，骨軟骨缺損的外科手術治療取決于病變的嚴重程度。微骨折骨髓刺激法常用于治療小面積的軟骨缺損，這種方法通過刺激軟骨下骨中間充質干細胞修復軟骨組織，但再生的軟骨組織與原軟骨組織組成和結構并不一致。自體移植或同種異體移植用于治療1～4 cm2范圍內的病變，但自體移植組織的供應受到限制，而同種異體移植組織可能存在發生微生物感染的風險。嚴重的骨軟骨缺損需要進行全關節置換手術，但存在假體磨損和松動的風險[32]。盡管這些療法在不斷進步和發展，但由于其局限性仍要求研發新的療法。骨軟骨組織工程利用各種生物材料和合成材料模擬天然骨軟骨組織的梯度特征，制備具有維持、替代或再生骨軟骨組織的骨軟骨仿生梯度支架。

2.1 骨軟骨組織工程中的細胞和生長因子

用于骨軟骨組織重建的自體細胞來源短缺，限制了間充質干細胞的應用[33]。在使用祖細胞或間充質干細胞進行骨軟骨組織工程的研究中[14]，載有生長因子的骨軟骨仿生梯度支架可導致間充質干細胞高度的分化。由于生長因子在體內的生物半衰期短，因此需要延長釋放生長因子的時間，并要求生長因子與靶細胞之間的擴散距離較短，以最大化生長因子的活性。例如，載有轉化生長因子的明膠微球可用于誘導間充質干細胞組裝成細胞聚集體，進一步可刺激細胞聚集體形成軟骨，這可以通過其產生的DNA、糖胺聚糖和Ⅱ型膠原的量對再生軟骨進行評估[34]。

骨軟骨仿生梯度支架也可以預接種嵌入式骨髓間充質干細胞，但由于預接種細胞分泌的細胞外基質會觸發免疫反應，使得骨軟骨仿生梯度支架顯示出不良反應，導致不良的愈合過程[35]。因此，在某些情況下更優先使用無細胞預接種的骨軟骨仿生梯度支架，但必須對骨軟骨仿生梯度支架進行生物活性分子預修飾，以誘導周圍祖細胞或多功能干細胞的黏附和分化。生長因子是觸發組織再生所需的細胞級聯反應內信號的關鍵生化因素，因此它們通常被摻入骨軟骨仿生梯度支架中，以傳遞促進有絲分裂活性和誘導新血管形成的生化信號[36]。例如，常見的轉化生長因子具有誘導干細胞分化為上皮細胞和成纖維細胞的功能，通常用于加速傷口愈合和促進軟骨成骨。同時，需要骨形態發生蛋白誘導和維持特定組織的特性，以再生諸如軟骨下骨之類的硬組織[14,37]。例如在一項人類臨床實驗中[38]，摻入重組人骨形態發生蛋白的膠原海綿比自體植骨具有更可靠的骨誘導作用。

2.2 骨軟骨組織工程中的材料

性能優異的生物材料在開發理想的骨軟骨仿生梯度支架方面起著至關重要的作用。目前，研究人員已開發了多種材料來制備骨軟骨仿生梯度支架，包括天然聚合物材料(膠原蛋白/明膠[39]、纖維蛋白[40]、絲素蛋白[41-42]、甲殼素/殼聚糖[39]、硫酸軟骨素[43]、透明質酸[44]、藻酸鹽[42,45])、人工合成聚合物材料(聚己內酯[1,37]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物[39]、聚乙醇酸[39]、聚乙二醇[45]、聚乳酸[39]和聚醚醚酮[46]等)、生物活性材料(羥基磷灰石[47-49]、磷酸鈣[39]和生物活性玻璃)以及多孔鈦合金材料等[50]。它們與細胞外基質的結構相似且具有良好的生物相容性。例如，膠原蛋白為結締組織的主要成分，而且是骨軟骨仿生梯度支架制造中常用的天然聚合物材料。天然聚合物材料具有較快的生物降解速率，由單一膠原材料制備的支架缺乏維持結構完整的力學性能，可以進行交聯處理以延長其耐久性和機械強度。明膠具有低成本和易于制備的特點，但力學性能較差，通常與其他材料(例如羥基磷灰石和殼聚糖)結合使用。絲質材料穩定，柔韌性好，并且具有很高的抗拉和抗壓能力，也用于骨軟骨仿生梯度支架的制造[41]。盡管天然聚合物更加親和天然軟骨組織，但由于穩定性和機械強度低等原因，需要與其他合成材料或生物活性材料聯合使用。合成生物材料因其優異的力學性能、良好的生物相容性和高度可定制化而被廣泛研究。但大多數合成聚合物材料具有疏水性，相互作用位點數量不足，可能會導致細胞黏附和分化方面的限制，因此可將疏水性和親水性聚合物混合使用，用于增強親水性并促進細胞附著。羥基磷灰石、磷酸鈣和生物玻璃等生物活性材料能夠刺激生物礦化以修復骨軟骨組織[20,37]。在一些研究中[19,51]，通過改變磷酸鈣中鈣磷比可以控制骨軟骨仿生梯度支架的生物降解性，但生物活性材料很脆并且不能抵抗機械應力，因此也需要與天然材料和合成材料聯合使用。

3 3D打印和有限元建模用于骨軟骨仿生梯度支架制備

3.1 3D打印用于骨軟骨仿生梯度支架制備

骨軟骨仿生梯度支架的制造不僅需要優良的生物材料，而且需要合適的制造方法。制造方法可以分為常規方法[51]和3D打印方法[4,52]。常規的骨軟骨仿生梯度支架制造方法(例如溶劑澆鑄、氣體成型、冷凍干燥和靜電紡絲)具有高性價比，且在一定程度上可以對骨軟骨仿生梯度支架的孔隙率和孔徑進行控制[53]。然而，相比較常規方法，基于CAD模型的3D打印技術可對支架宏觀和微觀特征進行獨立的調控，能夠進一步開發具有特定結構的骨軟骨仿生梯度支架。經過近些年的發展，3D打印已成為一種用于骨軟骨仿生梯度支架制造的重要方法。在3D打印中，通過計算機輔助設計模型指導骨軟骨仿生梯度支架逐層制造，此方法可以很好地控制支架孔的幾何形狀[6]。3D打印可制造100%互連的孔結構并優化支架的力學性能[37,52]。目前，已有幾種3D打印技術用于創建骨軟骨組織仿生梯度支架，包括基于固體(例如熔融沉積建模)、基于粉末(例如選擇性激光燒結和選擇性激光熔化)和基于液體(例如噴墨打印、立體光刻和生物打印等)的技術[11]。然而，各種3D打印技術都有其優勢和局限性。一方面，熔融沉積建模可以用來創建支架梯度結構，但由于其高溫處理，難以在骨軟骨仿生梯度支架內部獲得材料梯度，且在打印過程中不能預接種干細胞和生物活性因子。同理，在選擇性激光燒結和激光熔化過程中，涉及粉末前體的燒結或熔化，也不能預接種干細胞和生物活性因子。另一方面，在室溫下，可以使用基于液滴和擠壓的生物打印工藝來處理預接種生長因子和干細胞的骨軟骨仿生梯度支架。然而，使用這種方法難以制造具有復雜幾何孔形狀的骨軟骨仿生梯度支架[6,54]。

盡管3D打印技術有一定的局限性，但它正在推動骨軟骨仿生梯度支架向個性化發展方向轉變。例如，可以將個人的關節掃描圖像轉換為計算機輔助設計圖像，然后將其用于定制患者所需的骨軟骨仿生梯度支架[6,54]。這種個性化的骨軟骨仿生梯度支架，不僅可在軟骨下骨和軟骨之間提供連續的梯度，而且還能在骨軟骨仿生梯度支架和宿主組織之間提供連續的過渡。此外，在逐層3D打印過程中，可以將幾種類型的細胞、生長因子和生物材料預接種在骨軟骨仿生梯度支架內部，因此，3D打印技術能夠提供符合骨軟骨單元梯度特性的方案。通過3D打印制造的骨軟骨仿生梯度支架包括材料梯度和結構梯度。例如Gao等[17]配制了聚(N-[三(羥甲基)甲基]丙烯酰胺)共聚水凝膠(PNT)生物油墨，采用生物3D打印技術制造了一種骨軟骨仿生材料梯度支架，其頂層是含有PNT和轉化生長因子的水凝膠，底層是含有PNT和磷酸鈣的水凝膠。體外測試結果表明，轉化生長因子和磷酸鈣改善了骨髓間充質干細胞的增殖和分化；體內動物研究表明，該骨軟骨仿生梯度支架可以促進骨軟骨再生。

3.2 有限元建模用于骨軟骨仿生梯度支架制備

隨著3D打印技術的進一步發展，有限元建模方法結合3D打印技術已被用來設計和分析骨軟骨仿生梯度支架，從而使研究人員能夠探索骨軟骨仿生梯度支架拓撲、力學性能和組織再生之間的關系。例如，在Liu等[7]和Xu等[50]的研究中，利用具有晶格結構的鈦合金設計了6種不同類型支桿半徑的復合晶格結構，包括簡單立方(結構A)、體心立方(結構B)和邊心立方(結構C)單元格。首先通過有限元方法對支架的設計結構進行仿真和分析，然后使用選擇性激光熔化法制造具有最佳晶胞和支桿半徑的鈦晶格(CP-Ti)結構。研究結果表明，在6種類型的復合晶格結構中，BA,CA和CB組合結構具有較小的最大Von-Mises應力，表明這些結構具有較高的強度。根據應力/比表面積對支撐桿半徑的擬合曲線，BA，CA和CB結構的最佳支柱半徑分別為0.28，0.23 mm和0.30 mm，其相應的壓縮屈服強度和壓縮模量分別為42.28,30.11 MPa和176.96 MPa，以及4.13,2.16 GPa和7.84 GPa。具有CB單元結構的CP-Ti與皮質骨強度和壓縮模量相似，使其成為軟骨下骨修復潛在的應用材料。有限元分析方法與3D打印技術相結合，拓展了可調機械強度的骨軟骨仿生梯度支架的制造方式，該骨軟骨仿生梯度支架可動態模擬各種生物組織的機械特性。

4 骨軟骨仿生梯度支架的制備

由前述可知，天然材料、合成材料或生物活性材料性能較為單一，因此使用復合材料的骨軟骨仿生梯度支架具有更優異的綜合性能[20,39]。例如，Golafshan等[55]采用聚己內酯(PCL)和Sr2+離子改性的生物活性材料磷酸鎂(MgP)通過3D打印技術制備了聚合物/生物活性材料復合支架(MgPSr-PCL30)，其具有與純聚己內酯支架相似的應力應變行為。聚合物含量的增加導致復合材料的彈性模量和屈服應力均降低。與純聚己內酯支架相比，MgPSr-PCL30的彈性模量和屈服應力分別增加了4.5倍和2.7倍，達到36.8 MPa和4.3 MPa。此外，MgPSr-PCL30的彈性模量比MgPSr-PCL40和MgPSr-PCL50分別提高1.5倍和2.3倍。在MgPSr陶瓷相中添加40%或30%聚己內酯后，復合支架的抗壓強度分別達到375.5 kJ/m3和324.8 kJ/m3。MgPSr-PCL30是一種具有高3D打印分辨率、高抗壓韌性(324.8 kJ/m3)和10%拉伸應變的復合生物材料。因此，復合生物材料在骨軟骨仿生梯度支架制備中可調控其力學性能，具有更加明顯的優勢。

此外，添加不同天然材料、合成材料或生物活性的復合材料可更好地模擬天然骨軟骨組織內軟骨-鈣化軟骨-軟骨下骨的梯度。一些研究者[6]通過使用復合材料開發出離散型和連續型的骨軟骨仿生梯度支架(圖2所示)。在離散型骨軟骨仿生梯度支架中，每層相對應于天然骨軟骨組織的各個不同的層，而連續骨軟骨仿生梯度支架中過渡是漸變發生的。

圖2 離散型骨軟骨仿生支架和連續型骨軟骨仿生支架示意圖[6]Fig.2 Schematic representations of discrete and continuous gradient osteochondral scaffolds[6]

4.1 離散型骨軟骨仿生梯度支架

離散梯度支架可分為雙相或多相支架，將單個軟骨下骨支架和軟骨支架連接即可構成雙相骨軟骨仿生梯度支架。Shen等[18]制備由大孔纖維蛋白上層支架和硅灰石下層支架(CS-Mg8)整合而成的離散型骨軟骨仿生梯度支架，體內外實驗表明骨髓間充質干細胞黏附在CS-Mg8支架上并顯示出良好的遷移。Zhao等[56]制備了多孔聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和多孔鈦(Ti)雙相結構，體內實驗結果表明PLGA/Ti骨軟骨仿生梯度支架比PLGA或Ti支架具有更好的骨軟骨組織修復功能。此外，Chen等[57]也開發了一種雙相離散型骨軟骨仿生梯度支架，其中轉化生長因子活化的殼聚糖/明膠用于軟骨形成層，而骨形態發生蛋白活化的羥基磷灰石/殼聚糖/明膠則用于軟骨下骨形成層。將接種間充質干細胞的支架植入兔膝關節缺損模型12周后顯示，該骨軟骨仿生梯度支架能夠促進骨軟骨組織再生。三相/多相離散型骨軟骨仿生梯度支架具有與天然骨軟骨組織中的軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨更加相似的狀態。例如，Jiang等[58]開發了三相骨軟骨仿生梯度支架，PLGA和接種成骨細胞的生物活性玻璃用于創建軟骨下骨層，軟骨細胞接種的瓊脂糖水凝膠形成軟骨層，PLGA和瓊脂糖水凝膠的組合產生鈣化軟骨層，體外實驗結果表明各層均可形成適當的骨軟骨組織。總而言之，在大多數研究中使用生物相容性優異的天然生物材料構成離散梯度支架的軟骨層，力學性能優異的合成材料(或摻雜生物活性材料的天然生物材料)構成離散梯度支架的成骨層，但是離散型支架上下層界面之間力學性能差異較大，這種差異造成了支架發生潛在斷裂的風險。

4.2 連續型骨軟骨仿生梯度支架

與離散型骨軟骨仿生梯度支架相比，連續型骨軟骨仿生梯度支架具有誘導骨軟骨組織成分之間平滑過渡的潛力，降低了界面的不穩定性。Bittner等[59]制備了具有結構梯度和材料梯度的PCL/羥基磷灰石連續型骨軟骨仿生梯度支架，其通過改變孔徑(0.2，0.5 mm或0.9 mm)和羥基磷灰石的含量(0%，15%或30%)來實現。Gao等[17]通過一步共聚法，合成了可3D打印的高強度熱響應性N-丙烯酰基甘氨酰胺共聚N-[三(羥甲基)甲基]丙烯酰胺超分子水凝膠，可控的3D結構證明該連續型骨軟骨仿生梯度支架制備成功。該支架通過一體化構造，具有出色的力學性能，拉伸強度高達0.41 MPa，伸長率高達860%，抗壓強度高達8.4 MPa，能夠有效降低支架植入體內后受應力作用發生界面斷裂的可能性。同時，這種上下層分別預接種了轉化生長因子和磷酸鈣的連續型骨軟骨仿生梯度支架，可促進骨髓間充質干細胞的附著、擴散以及成軟骨和成骨分化，通過大鼠模型實驗表明它顯著促進了軟骨和軟骨下骨同時再生。Dormer等[60]使用微流控技術開發了連續型PLGA骨軟骨仿生梯度支架，支架的頂部和底部四分之一分別包含轉化生長因子和骨形態發生蛋白，同時把間充質干細胞接種在PLGA梯度支架上，體外實驗結果表明，成骨分化和堿性磷酸酶的活性均得到改善。此外，Parisi等[54]通過從底部到頂部改變膠原蛋白與羥基磷灰石的比例開發了連續型骨軟骨仿生梯度支架。支架的底部具有高含量的羥基磷灰石，羥基磷灰石含量向頂部逐漸減少至零，通過調節生物材料組成將支架從成軟骨區域漸變為成骨區域，同時調節支架的力學性能和生化性能。總而言之，連續型骨軟骨仿生梯度支架在材料組成方面具有更好的連續性，整體力學性能更加穩定，與天然骨軟骨組織結構更加相似。表2[3,17-19,54,57,60-63]總結了在動物實驗研究中評估過的典型的骨軟骨仿生梯度支架功能和效果。

表2 用于動物體內研究的骨軟骨仿生梯度支架的性質和性能[3,17-19,54,57,60-63]Table 2 Properties and performance of scaffolds used for in vivo animal studies[3,17-19,54,57,60-63]

近些年來，盡管骨軟骨組織工程領域取得了顯著的進展，但要重建具有和天然骨軟骨組織類似結構和功能的支架材料仍需進一步研究，同時也需要降低離散型梯度支架發生潛在斷裂的風險。Qiao等[64]受天然骨軟骨組織中細胞外基質組成和膠原纖維結構所啟發，設計并制造了由聚ε-己內酯-聚乙二醇(PCEC)組成的三相骨軟骨仿生梯度支架，包括淺軟骨層、深軟骨層和軟骨下骨層，并且將負載特異性生長因子和間充質干細胞的甲基丙烯酰胺化明膠水凝膠填充在支架中，如圖3所示。將PCEC纖維引入到明膠水凝膠中可顯著提高其機械強度，并在一定程度上降低支架斷裂的風險。在隨后進行的動物實驗中發現，三相骨軟骨仿生梯度支架組在術后24周時可實現軟骨和軟骨下骨同時再生，其宏觀修復評分顯著高于其他組。更為重要的是，引入淺軟骨層可以使再生的軟骨組織具有一定的潤滑和抗磨損性能，其表面粗糙度更低，摩擦因數更小。上述結果表明，該三相骨軟骨仿生梯度支架在未來臨床研究中具有良好的應用前景。

圖3 骨軟骨仿生梯度支架的制備過程示意圖[64](a)通過生物3D打印制備三相骨軟骨仿生梯度支架；(b)將載有細胞和生長因子的明膠水凝膠前體溶液依次注入到支架網絡后，紫外光交聯；(c)骨軟骨仿生梯度支架在骨軟骨組織誘導和再生中的應用Fig.3 Schematic diagrams showing the preparation process and application scenario of the tri-layered fiber-reinforced and GF-loaded hydrogel construct[64](a)fiber networks for the S,D and B layers were fabricated by meltelectrowriting;(b)integrated tri-layered composite was constructed using the UV-assisted,stepwise infiltration and crosslinking procedures.As shown, with the assistance of UV-crosslinking,the cell and growth factor-laden GelMA hydrogel precursor solution of the respective layer was successively infused into the fiber networks for the B,D and S layers to construct the tri-layered fiber-reinforced hydrogel composite;(c)application of the tri-layered composite scaffold in layer-specific osteochondral tissue induction and regeneration

5 商業骨軟骨仿生梯度支架

目前，采用臨床實驗評估骨軟骨仿生梯度支架設計的研究較少，可商購的骨軟骨仿生梯度支架主要是模仿整個骨軟骨單元的雙相或三相結構。Exactech開發的“TruFit”是一種經典的雙相骨軟骨仿生梯度支架，它是由多孔PLGA/聚乙醇酸和磷酸鈣組成[65]。盡管臨床實驗顯示“TruFit”支架一年內具有穩定的骨軟骨組織修復功能，但“TruFit”與周圍骨軟骨組織整合不充分，長期修復結果還需進一步觀察。Dell’osso等[66]指出，如果該骨軟骨仿生梯度支架的設計可用其他方法更相似地模擬天然骨軟骨組織，則“TruFit”骨軟骨仿生梯度支架將表現出更好的性能。

此外，Finceramica開發的“MaioRegen”是一種正在進行臨床實驗的骨軟骨仿生梯度支架。它的軟骨層由Ⅰ型膠原組成，鈣化軟骨層由60%的Ⅰ型膠原蛋白和40%的鎂-羥基磷灰石組成，骨層由30% Ⅰ型膠原和70%鎂-羥基磷灰石組成。一些病例報道顯示MaioRegen具有良好的治療效果[67]。在該例子中，一名患者通過術前MRI檢查診斷為髕骨外側關節面軟骨的ICRS Ⅳ度損傷。在手術過程中該處損傷被植入了一塊2.5 cm2大小的MaioRegen支架。術后2年的隨訪中，患者的膝關節疼痛明顯緩解，膝關節功能也較術前大幅提高，臨床方面的改善十分明顯。然而文中沒有給出患者隨訪的MRI資料，所以影像學評估尚不明確。在另一些病例報道中[68]使用MaioRegen支架對10例骨軟骨缺損患者進行了臨床研究，其中6例為膝關節骨軟骨缺損，4例為踝關節骨軟骨缺損。結果表明，術后1年和2.5年隨訪中，雖然膝關節的臨床功能評分有部分改善，但踝關節的臨床功能較術前變化不大。此外更值得注意的是，影像學方面，術后只在2名患者中觀察到不完全的骨缺損修復，而MRI評估則提示軟骨的再生幾乎為零。患者的關節表面沒有完整或與周圍宿主組織完全融合。基于這項研究的結果，一些國家建議謹慎使用MaioRegen支架。盡管市售的骨軟骨仿生梯度支架結構層次類似于天然骨軟骨組織結構，但仍然需要進一步改進來提高骨軟骨仿生梯度支架的組織再生能力。

6 展望

作者根據骨軟骨組織從軟骨表層到軟骨下骨在生化組成、結構和力學性能方面的梯度特性，討論了骨軟骨仿生梯度支架模擬天然骨軟骨組織梯度特性進行骨軟骨組織修復的研究進展。為了復合多種材料的優良性能以及控制骨軟骨仿生梯度支架的孔徑和孔隙率，一方面，性價比高的常規制造方法已被用于骨軟骨仿生梯度支架的制造；另一方面，基于CAD設計的3D打印技術可調控孔的幾何形狀并能夠構造高度互連的孔結構，在骨軟骨仿生梯度支架加工方面具有較大的潛力。該方法的局限性之一是缺乏用于骨軟骨仿生梯度支架加工的合適材料，需要進一步發展無毒、可控生物降解、成軟骨和成骨特性的新合成或復合材料。3D打印技術制備的骨軟骨仿生梯度支架與CAD模型之間存在顯著差異，因此，需要為骨軟骨仿生梯度支架制造優化3D打印過程。此外，有限元模擬和3D打印技術的結合為骨軟骨仿生梯度支架的發展提供了新思路。使用有限元建模方法，在壓縮載荷和流體動力環境下，根據壓縮應變和流體壁剪切應力，對3D打印的骨軟骨仿生梯度支架模型進行評估是一種高性價比的方法。

相比于離散型骨軟骨仿生梯度支架，連續型骨軟骨仿生梯度支架可以更相似地模擬天然骨軟骨組織單元的結構，且各層之間不會產生性能突變。因此，連續型骨軟骨仿生梯度支架在整體性能方面比離散型骨軟骨仿生梯度支架更有應用前景。盡管在骨軟骨組織再生方面，大多數骨軟骨仿生梯度支架在體內外實驗中均取得了良好的效果，但長期的臨床研究并未提供令人滿意的結果，仍然需要對骨軟骨仿生梯度支架進行進一步深入研究。