白酒風味物質研究進展及關鍵技術分析

吳成林，胡家藝，張惟廣

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

白酒是我國傳統發酵飲品，已有上千年歷史，是世界六大蒸餾酒之一。白酒中水和乙醇占比為98%～99%，剩余1%～2%為白酒中各種微量物質，而這些微量物質是影響白酒呈香呈味的關鍵性成分，決定了白酒的品質分級[1]。隨著生產工藝的優化，白酒香型在清香型、醬香型、濃香型為主香型基礎上，又相繼增加了芝麻香型、兼香型、米香型、鳳香型、老白干香型、馥郁香型、藥香型、豉香型、特香型等9種香型，對風味研究的需求更加迫切[2]。微量成分的研究不僅可以提升白酒口感風味，還能為白酒生產過程中菌種的選擇、釀酒原料的選擇等提供參考[3-4]。現有白酒揮發性成分分析主要對關鍵風味物質進行篩選，產生了氣相色譜-聞香（gas chromatography-olfactometry，GC-O）的研究方法，形成了以“感官導向分離”為核心的“感官組學”的研究體系[5]。本文對白酒風味物質的篩選技術以及白酒風味成分研究進展進行綜述，旨在為白酒風味研究和技術發展提供參考。

1 白酒風味物質研究進展

從1964年中國輕工業部設定試點開始，現代化白酒微量成分的研究已經有將近60年的歷史[6]，期間從紙層析色譜法到氣相色譜技術再到全二維氣相色譜飛行時間質譜技術（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）用了40多年的時間，鑒定出的香味成分也由最初的50多種到2017年的1 874種[7-9]。2007年以后，運用氣相色譜質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、GC-O、氣相色譜結合火焰光度檢測器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）等技術檢測白酒風味越來越普及。特別是GC×GC-TOFMS在白酒風味檢測中的應用，將檢測出的微量成分數量提升了一個數量級。季克良等[10]通過全二維氣相色譜/飛行時間質譜聯用檢測技術對白酒微量成分進行檢測，鑒定出醬香型、濃香型、清香型白酒的組分數量分別達到了873、342、178種。徐占成等[11]通過攪拌吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）技術和GC×GC-TOFMS聯用對白酒進行香味成分鑒定，分別從醬香型白酒、清香型白酒中檢測出1 700、1 300種左右的微量成分，另外從某品牌白酒中檢測出1 870組成分，其中準確定性出1 227種微量成分。隨著現代技術的發展，白酒微量成分檢測效率提高很快。因此，將多種現代先進檢測技術引用到白酒風味領域進行分析檢測是非常必要的。

1.1 頂空固相微萃取技術在白酒風味研究進程中的應用

張麗敏等[12]首次將氣相色譜技術和氫火焰離子光度檢測器相結合用來檢測清香型白酒酒體香型和微量成分，發現隨著時間的延長，低沸點、低水溶性的酯類物質逐漸減少，而高沸點且水溶性強的物質如酸、醇、羰基類化合物則逐漸增加。張五九等[13]將頂空固相微萃取技術結合氣相色譜質譜技術對豉香型白酒微量成分進行了定量分析，定量出的微量成分達到了118種，相比之前定量出的66種，多出了50多種。張明霞等[14]利用頂空固相微萃取與氣質聯用相結合的方法分析白酒香氣物質組成，從白酒原酒中萃取到42種香氣物質，其中包括酯類26種、酸6種、醇5種、醛2種、醚2種、酸酐1種。Zheng等[15]采用氣相色譜-質譜聯用技術對兩種典型濃香酒的頭、心、尾3個蒸餾階段的36種原酒的揮發性成分進行了鑒定和半定量。在所有的酒中總共鑒定出63種化合物，結合主成分分析和偏最小二乘判別分析認為其中3-甲基丁醇、己酸、己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、1，1-二甲氧基乙烷和1，1-二乙氧基-3-甲基丁烷是被測白酒中某兩種白酒的主要風味物質，這也是首次將多元分析方法結合氣相色譜-質譜技術對濃香型原酒進行鑒別。張媛媛等[16]采用液-液萃取、固相微萃取法結合氣相色譜、氣相色譜-嗅聞儀聯及氣相色譜-質譜聯用方法分析芝麻香型白酒中含硫特征風味物質，檢測到二甲基二硫醚、二甲基四硫醚、3-甲硫基丙醛、糠硫醇、二異丙基二硫、二糠基二硫醚和甲基甲烷硫代磺酸酯等物質。其中二甲基四硫醚、糠硫醇、二異丙基二硫、二糠基二硫醚和二甲基硫代亞磺酸酯是首次在芝麻香型白酒中發現。李賀賀等[17]采用頂空固相微萃取和攪拌棒吸附萃取技術結合氣相色譜-質譜聯用儀對酒樣香氣成分進行提取分析。共定性出190種化合物，其中用標準品準確定性143種。在白酒中首次發現4種酯類化合物:3-甲基丁酸己酯、丁酸辛酯、癸酸丙酯、癸酸異丁酯。郝飛龍等[18]通過頂空固相微萃取、液液萃取結合氣相色譜質譜技術、GC-FID技術，對3個系列的白酒定性、定量分析，共定性、定量出57種香氣化合物，3種酒共有的化合物有51種。通過香氣活性值（odor activity values，OAV）計算，酯類、脂肪酸類、醇類化合物的含量相對較高，是主要的香氣組成成分。Jin等[19]采用頂空固相微萃取氣相色譜-質譜聯用儀，通過冗余分析揭示了微生物群落與醬香型風味酒揮發性特征之間的相關性。證明了桿菌與吡嗪類密切正相關，乳酸菌與酯類密切正相關，曲霉與吡嗪類、酯類和芳香類之間的相關性。Zhu等[20]應用氣相色譜-嗅覺法、氣相色譜質譜法、火焰光度法、氮磷檢測法和氣味活度法對白酒中重要的硫、氮化合物進行了表征，3個樣品中分別含有60、62、61個芳香貢獻化合物。結果表明，2-甲基-3-呋喃硫醇（OAV:20～30）、3-巰基乙酸酯（OAV:13～20）、丁馬馬酮（OAV:30～57）、（E）-2-壬烯醛（OAV:9～22）、庚醛（OAV:4～13）、己醛（OAV:9～12）和2-異丙基-3-甲氧基吡嗪（OAV:4～14）對酒的香氣有促進作用。這是國內首次采用火焰光度檢測器和氮磷檢測器對酒中含量較低的硫、氮化合物進行測定。Ma等[21]采用頂空固相微萃取和同步蒸餾萃取法分別對藥酒中揮發性成分進行了提取，并用氣相色譜-質譜和氣相色譜-嗅覺法對其進行了定性和定量分析。通過GC-MS共鑒定出133種揮發性化合物，包括酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、呋喃類、萜類和其它雜類化合物。共有66個芳香活性化合物被GC-O進一步識別，其中43個由于OAV值較高被確定為關鍵芳香化合物。

從2002年發展至今，頂空固相微萃取技術作為一種運用廣泛、便捷的前處理技術，它可以結合不同前處理技術和檢測方法，檢測出大量的、未知的化合物質，也能對不同香型白酒的特征風味物質進行鑒定、定性定量不同組分以及驗證微生物種類和白酒風味之間的關系。頂空固相微萃取技術的使用大大加快了白酒風味的研究進程，因此探索出更多的前處理技術和檢測方法，提高頂空固相微萃取技術的使用范圍變得尤為重要。

1.2 白酒感官分析發展

范文來等[22]依托“169”計劃，按照國際環境條件，參考閾值測定美國國家標準，制定出國際領先的“中國白酒風味物質嗅覺閾值測定方法體系”，并成功測定出包括酯類、醇類、醛類、脂肪類、吡嗪類、呋喃類等77種物質的嗅覺閾值，這給后來的研究人員對白酒的風味輪廓圖描繪奠定基礎。劉明等[23]借鑒感官科學分析原理和描述詞引用頻率方法，首次驗證了感官描述分析技術客觀評價白酒風味的可行性，為白酒風味輪的建立提供研究基礎。此后隨著GC-O技術結合香氣萃取稀釋分析法（aroma extract dilution analysis，AEDA）、香氣強度分析法以及香氣活性值的綜合運用[21，24-25]，通過將人體感官與儀器檢測相結合，使對白酒風味的分析結果更真實、全面。白酒風味分析得到了長足的發展，截至目前為止，已發現的白酒風味物質達到了2 000多種[26]，其中確定濃香型的主體香是己酸乙酯，濃香型白酒中的己酸乙酯的OAV均大于500，同時發現丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯等酯類也起著較大的作用[27]；清香型的主體香是乙酸乙酯，比較重要的風味化合物有辛酸乙酯、己酸乙酯、2-羥基-3-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛，其中辛酸乙酯為清香型白酒特有的香氣成分[28]。而醬香型的主體風味物質還沒有被探究出來，但相較于其它幾種香型來說，由于其成分的復雜性，它的主體香可能不是由單一的某種物質組成，而是由多種極微量成分共同決定的[25，29-31]。

主體香并不僅是由風味成分的絕對含量決定的，還與它的閾值相關，如土味素、β-大馬酮等化合物含量只有10-9g/mL左右，但因其閾值較低對整體風味也會產生影響[32]。不同香型白酒的主體香和關鍵風味物質的確定，對我國白酒生產工藝的改進、對白酒品質穩定以及白酒產業的發展都具有極大的促進作用。感官分析方法的不斷進步，結合現代高科技手段，使得白酒風味檢測技術愈發完善。

2 關鍵技術分析

白酒的風味成分分析主要是檢測一些極其微量的成分，所以往往需要先將這些微量成分先從水和乙醇中提取出來，運用GC-MS或GC-FID分析檢測，之后結合GC-O與AEDA、時間-強度法（odor specific magnitude estimation，OSME）聯用等方法，將一些對風味起到重要作用的物質篩選出來，最后通過香氣重組試驗、香氣缺失試驗判定某一種或某一類物質對整體風味的貢獻，白酒關鍵風味物質分析過程如圖1所示。

圖1 白酒關鍵風味物質分析流程圖Fig.1 Flow chart of liquor key flavor substances analysis

2.1 前處理技術

白酒中的微量成分在檢測前需要進行處理，目的是去除后續檢測過程中的干擾成分，將微量成分濃縮富集便于檢測。選擇恰當的前處理方法能夠節省檢測時間、提高檢測準確性。目前在白酒風味檢測中運用較廣泛的前處理技術有液液萃取法、頂空固相微萃取法[33-37]。液液萃取法先將需要檢測的微量成分富集濃縮，再通過有機溶劑將其從基質中分離出來，所得成分較為完整，但在濃縮過程中可能會損失一些低沸點的揮發性物質[31]。范文來等[38]通過液液萃取和分餾技術結合GC-MS對綿柔型白酒進行分析，共檢測出933個峰，其中鑒別出化合物672種，同時也是首次檢測到萜烯與內酯類化合物。而頂空微萃取則對于這些低沸點物質具有較好的吸附效果，這兩種方法互為補充，可以更好地將白酒中的微量成分從基質中較完整地提取出來。白酒風味檢測前處理技術特點比較如表1所示。

表1 白酒風味檢測前處理技術比較Table 1 Comparison of pre-treatment technology of flavor substances of liquor

2.2 檢測方法

2.2.1 氣相色譜-質譜檢測

在白酒微量成分分析中，最常用的檢測技術就是GC-MS，它的工作原理是氣相色譜通過色譜柱對微量成分的吸附度不同進行分離，然后流出的微量成分先后進入質譜模塊中的離子源形成離子，通過電場和磁場的作用將不同質荷比離子分開形成質譜，達到定性定量的目的[50]。GC-MS分離速度快、分離效果好且所需樣品量少，因此在白酒、茶類產品等揮發性成分分析、血液和尿液中藥物成分的檢測、石油摻假檢測中被廣泛應用。在白酒風味檢測中，Li等[51]用GC-MS、GC-O、GC×GC-TOFMS對芝麻香型白酒關鍵風味物質進行研究，苯甲醇是首次在白酒中被檢測出來，被認為是一種新的對芝麻香型白酒風味有重要貢獻的物質。但在白酒風味成分檢測中，靠單一的氣質檢測并不能滿足所有要求，由于存在檢測限的問題，對于一些含量低于或者高于GC-MS檢測限的微量成分則容易被漏檢，所以對于一些含量高或者痕量成分的檢測需要輔助其它方法，如GC-FID技術。

2.2.2 氣相色譜與檢測器聯用技術

在白酒微量成分檢測中，有時會有一些微量成分通過GC-MS等技術無法檢測出來，此時氣相色譜與單一檢測器聯用檢測技術可以很好地解決這個問題。常見的氣相色譜與檢測器聯用技術為氣相色譜-火焰離子化檢測器聯用。火焰離子化檢測器是一種高靈敏度檢測器，對絕大多數有機物都有響應。郝飛龍等[18]運用GC-FID結合矯正因子法對3個系列的白酒進行定量分析，檢測出酯類結合物中辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯含量較高；脂肪酸類化合物中2-甲基丙酸、丁酸含量較高；芳香族及酚類化合物中β-苯乙醇含量最高。常用離子化檢測器使用范圍見表2。

表2 常用離子化檢測器使用范圍Table 2 Application scope of common ionization detector

續表2 常用離子化檢測器使用范圍Continue table 2 Application scope of common ionization detector

2.3 風味物質定性、定量解析

2.3.1 定性分析

白酒微量成分定性分析中，最常用的方法是樣品通過GC-MS譜庫檢索，通過譜庫檢索對待測物質進行初步定性，不同的譜庫給出的檢索結果會有少許偏差。經過初步定性后，就可以通過計算保留指數（retention index，RI），進行再次定性，該方法叫標準品定性法。其原理是通過在進樣前，加入一定濃度的碳標混合物（C6-C30），進入質譜系統的碳標混合物會因為電場力與磁場力的共同作用而按自身重量依次流出，通過碳標能計算出未知化合物的RI，將計算得到的值與搜索文獻查到的RI做比較，就能確定未知物的種類。最后還可以利用GC-O系統進行鑒定結果準確性，通過相同的升溫程序和參數設置，對在固定出峰時間的化合物的氣味比對，可以進行再次判斷。

在用氣相色譜-嗅覺測量法進行香味識別定性后，為了分析各種物質對白酒風味貢獻度的大小，可采用GC-O結合OSME或者AEDA進行判定。OSME法是指將濃縮的樣品經過嗅聞儀檢測，其結果用香氣強度表示。AEDA是將萃取濃縮后的樣品與溶劑以一定比例梯度稀釋后經嗅聞儀檢測進行聞香識別，直至稀釋到不能被識別為止，它的稀釋倍數就是稀釋因子（flavor dilution，FD）[31]。一般地，某揮發性成分的香氣強度值或稀釋因子越高，表明該組分對整體香氣貢獻度也越大。但由于白酒基質對香氣識別有很大的影響，所以僅靠單純的香氣強度值或者稀釋因子測定是不能準確反映白酒微量成分真實的風味貢獻。所以就引入了香氣活性值概念，香氣活性值表示香氣化合物的絕對濃度與該香氣化合物的香氣閾值濃度之比，用以表征某種香氣化合物對香氣貢獻的大小，OAV≥1時，表示該物質對風味有貢獻，數值越大表明貢獻度越高[52]。香氣活性值的計算，需要先測量未知物成分的含量，常用的定量分析方法有面積百分比法、歸一化法、內標法、外標法。

2.3.2 定量分析

2.3.2.1 面積百分比法（峰高百分比法）

運行中每個峰的面積（峰高）占所有峰面積（峰高）總和的百分數，無需校正，能夠實現簡單、快速定量，要求：所需測定的組分的峰面積必須非常準確，各化合物在檢測器上的響應相等并全部流出。

2.3.2.2 歸一化法

與面積百分比法一樣，都是計算出峰面積與總面積之比，歸一化法定量的前提需要提前查詢出所有待測微量成分的校正因子，且保證全部出峰且穩定。校正因子的使用是為了消除檢測器對不同化合物的靈敏度不同對定量造成的影響，而面積百分比法默認校正因子為1。

2.3.2.3 內標法

將一種或幾種內標物準確稱量后加入到試樣中，根據被測物和內標物的質量和色譜圖上的峰面積比相等，計算各組分含量。該方法要求必須在樣品中加入一個組分，易導致增加面積測量誤差。內標物的選擇要求：樣品組分中不含有的物質、含量接近被測組分、出峰在中間位置且不與樣品發生反應。白酒檢測中常用的內標物有叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸等[53-54]。

2.3.2.4 外標法（定量進樣-標準曲線法）

檢測被測組分的純物質來繪制濃度對響應值的標準曲線，然后測試被測樣品中被測組分的響應信號（峰面積或峰高），通過標準曲線計算出其含量。該法操作簡單，只需校正待測組分峰，但該方法要求進樣量準確且儀器穩定性良好。

3 關鍵風味物質的確定

將多種OAV值、FD值較大的化合物初步認定為對風味有突出貢獻的物質，但不同的化合物之間存在著相互作用的關系，從而導致一種（類）化合物對另一種（類）化合物香氣的增強或削弱。Lytra等[55]通過將4種紅酒酯類物質丙酸乙酯、3-羥基丁酸乙酯、乙酸丁酯和2-甲基丙酯在重組酒樣中缺失，驗證其對紅酒果香的影響，結果表明3-羥基丁酸乙酯和2-甲基丙酯缺失后，紅酒果香味減弱，表明它們在提高紅酒整體果香強度方面具有增強作用。杜靜怡等[56]通過風味重組試驗首次確認月桂酸乙酯和3-甲硫基丙醇是清香型白酒的重要香氣組分。所以，關鍵風味物質的確定，需要結合風味重組、風味缺失、風味添加等試驗方法，以排除白酒基質對風味物質的影響以及風味化合物之間的相互影響。

4 展望

隨著越來越多的新技術被應用到白酒揮發性風味物質的研究中來，在探索出更多未知的風味物質的同時，仍需要在許多方面進行深入探索。持續對前沿檢測技術進行探究，類似電子鼻、電子舌以及氣相色譜-嗅聞-質譜聯用等技術，對白酒風味物質檢測過程發揮著越來越重要的作用。對于白酒中檢測出來數量龐大的風味物質對人體作用的利弊，需要結合中醫學、營養學等進行判定，同時利用宏基因組學、代謝組學等手段，探索各種微生物在發酵生產過程中對這些風味物質的產生起到的作用。通過結合不同學科知識進行白酒風味解析，達到優化白酒生產工藝，提升白酒品質的目的。現有白酒關鍵揮發性風味物質的研究是白酒風味學的一個分支，對于白酒中難揮發性物質對其它物質作用的研究，以及在白酒品嘗過程中口腔溫度對風味感知的影響，需要結合人體感知和生理特性。此類相關研究在國內報道較少，將是未來白酒風味研究的發展方向。